Rekombinantní tkáňový aktivátor plazminogenu označuje TPA (tkáňový aktivátor plazminogenu, faktor III, tromboplastin, tPA). Léčba pacientů v akutním období

Obsah tématu "Eozinofily. Monocyty. Trombocyty. Hemostáza. Krevní koagulační systém. Antikoagulační systém.":
1. Eozinofily. Funkce eozinofilů. Funkce eozinofilních leukocytů. Eozinofilie.
2. Monocyty. Makrofágy. Funkce monocytů - makrofágy. Normální počet monocytů - makrofágů.
3. Regulace granulocytopoézy a monocytopoézy. Faktory stimulující kolonie granulocytů. Keylony.
4. Krevní destičky. Struktura krevních destiček. Funkce krevních destiček. Funkce glykoproteinů. Zóna sol - gel hyaloplazmy.
5. Trombocytopoéza. Regulace trombocytopoézy. Trombopoetin (trombocytopoetin). Megakaryocyty. Trombocytopenie.
6. Hemostáza. Mechanismy srážení krve. Destičková hemostáza. Reakce krevních destiček. Primární hemostáza.
7. Systém srážení krve. Vnější cesta pro aktivaci krevní koagulace. Faktory srážení krve.
8. Vnitřní cesta pro aktivaci krevní koagulace. trombin.
9. Antikoagulační krevní systém. Antikoagulační mechanismy krve. antitrombin. heparin. Proteiny. Prostacyklin. trombomodulin.
10. Aktivátor tkáňového plazminogenu. Ektoenzymy. Role endotelu v antikoagulačním systému. Tkáňový faktor. Inhibitor aktivátoru plazminogenu. von Willebrandův faktor. Antikoagulancia.

Aktivátor tkáňového plazminogenu. Ektoenzymy. Role endotelu v antikoagulačním systému. Tkáňový faktor. Inhibitor aktivátoru plazminogenu. von Willebrandův faktor. Antikoagulancia.

Aktivátor tkáňového plazminogenu je protein reprodukovaný a neustále vylučovaný vaskulárním endotelem. Poskytuje přímou lokální trombolytickou aktivitu proti vytvořenému trombu. V krvi je udržována stálá hladina tohoto faktoru, což zajišťuje systémovou trombolytickou aktivitu krve.

Ektoenzymy- Jedná se o endotelem produkovanou ADPázu, ATPázu a enzym konvertující adenosin. Endoteliální ADPáza rychle rozkládá proagregant ADP, vylučovaný aktivovanými krevními destičkami.

Cévní endoteliální buňky syntetizovat a protrombotické faktory: tkáňový faktor, inhibitory aktivátoru plazminogenu, von Willebrandův faktor.

Rýže. 7.11. Úloha endotelu krevních cév při srážení krve. Pod nápisem „Antikoagulancia“ jsou endoteliální faktory, které mají antikoagulační účinek v důsledku inhibice agregace krevních destiček, tvorby fibrinové sraženiny a aktivace fibrinolýzy. Pod názvem „Prokoagulancia“ jsou označeny endoteliální faktory podílející se na tvorbě trombu krevních destiček, fibrinové sraženiny a potlačení fibrinolýzy (

Tkáňový faktor je komplexní protein buněčné membrány o hmotnosti 46 kDa. Když je buňka poškozena, část její molekuly se pevně naváže na koagulační faktor Vila, čímž podporuje její funkci jako urychlovače v cestě vnější koagulace.

Inhibitor aktivátoru plazminogenu-I je 52 kDa protein nalezený v cirkulující krvi. Těsnou vazbou na aktivátor plazminogenu jej inaktivuje, čímž se podílí na regulaci fibrinolýzy v těle.

von Willebrandův faktor je multidimenzionální molekula o hmotnosti 1-20 milionů Da, syntetizovaná endotelem a uložená v endoteliálních sekrečních granulích. Uvolňuje se z nich, funguje jako adhezivní molekula pro krevní destičky a podporuje jejich agregaci. Zvýšené uvolňování von Willebrandova faktoru z endotelu je indukováno trombinem.

Srážení krve v cévě Hladký povrch endotelu také zabraňuje, zabraňuje zahrnutí vnitřní dráhy pro tvorbu aktivní protrombinázy. Monomolekulární proteinová vrstva adsorbovaná na povrchu endotelu odpuzuje srážecí faktory a krevní destičky a také zabraňuje srážení krve.

Antikoagulancia použito v klinická praxe. Například ke snížení zvýšené srážlivosti krve u pacientů s koronární onemocnění srdce, k udržení krve v kapalném stavu při použití kardiopulmonálního bypassu, což způsobuje trauma krevních buněk, v důsledku čehož je aktivována vnitřní cesta koagulace krve.

farmakologický účinek

Trombolytické. Rekombinantní lidský tkáňový aktivátor glykoproteinu plazminogenu.

Při intravenózním podání je lék v systémovém oběhu relativně neaktivní. Aktivuje se po navázání na fibrin, čímž dojde k přeměně plazminogenu na plazmin, což vede k rozpuštění fibrinové sraženiny.

Při použití Aktivizovat uvolňování enzymu alfa-hydroxybutyrát dehydrogenázy je sníženo.

aplikace Aktivizovat v dávce 100 mg po dobu 90 minut v kombinaci s iv heparinem u více než 40 000 pacientů s akutním infarktem myokardu (studie GUSTO) vedlo ke snížení 30denní mortality (6,3 %) ve srovnání s použitím streptokinázy (1,5 milionu jednotek) po dobu 60 minut) současně se subkutánním nebo intravenózním podáním heparinu (7,3 %). Bylo prokázáno, že po 60 minutách a 90 minutách trombolýzy u pacientů dostávajících Aktivizovat byla zjištěna vyšší frekvence obnovy cévní průchodnosti v infarktové zóně než při použití streptokinázy. 180 minut po zahájení terapie a později nebyly zaznamenány žádné rozdíly ve frekvenci průchodnosti cév.

Při použití Aktivizovat Došlo ke snížení 30denní mortality po infarktu myokardu ve srovnání s pacienty, kteří nedostávali trombolytickou léčbu.

U pacientů přijímajících Aktivizovat ve srovnání s pacienty, kteří nedostávali trombolytickou léčbu, došlo k méně významnému poškození obecná funkce levé srdeční komory a lokální pohyblivost stěny.

Placebem kontrolovaná studie (LATE) ukázala, že použití Aktivizovat v dávce 100 mg po dobu 3 hodin u pacientů s infarktem myokardu (v případě zahájení terapie během 6-12 hodin po nástupu příznaků) vedlo ke snížení 30denní mortality ve srovnání s placebem. Terapeutický účinek u pacientů s potvrzeným infarktem myokardu byl pozorován i v případech, kdy byla léčba zahájena do 24 hodin po nástupu příznaků.

U pacientů s akutní masivní embolií plicní tepna doprovázené nestabilní hemodynamikou, užívání Aktivizovat vede k rychlému zmenšení velikosti trombu a poklesu tlaku v plicnici, ale neexistují žádné údaje o mortalitě.

Ve dvou studiích provedených v USA (NINDS A/B), které sledovaly účinek léku u cévní mozkové příhody (v prvních 3 hodinách po nástupu příznaků), bylo častější dosažení příznivého výsledku (žádné postižení pacientů kapacita nebo minimální závažnost těchto poruch) ve srovnání s placebem.

Pokud je léčba zahájena později, účinnost léku klesá, jak bylo prokázáno ve dvou evropských studiích a v další studii provedené ve Spojených státech.

Výsledky metaanalýzy všech pacientů, kteří byli léčeni během prvních 3 hodin po propuknutí cévní mozkové příhody, potvrdily přítomnost pozitivního účinku alteplázy.

Přes zvýšené riziko závažného až fatálního intrakraniálního krvácení byla pravděpodobnost vývoje příznivého výsledku terapie ve srovnání s placebem 14,9 % (95% intervaly spolehlivosti: 8,1 % a 21,7 %). Tyto údaje neumožňují učinit definitivní závěry ohledně vlivu terapie na mortalitu. Poměr přínos/riziko použití alteplázy do 3 hodin od začátku cévní mozkové příhody (s výhradou výše uvedených upozornění) je obecně považován za příznivý, ačkoli údaje ze studií nejsou jednoznačné, pokud jde o účinek léčby na mortalitu.

Metaanalýza všech dostupných klinických údajů ukazuje, že altepláza je méně účinná u pacientů, jejichž léčba je zahájena 3-6 hodin po nástupu příznaků, ve srovnání s terapií zahájenou do 3 hodin po nástupu klinických projevů. Navíc je riziko komplikací iktové terapie v prvním případě vyšší, což vede k nepříznivému poměru přínos/riziko.

Vzhledem ke své relativní specifičnosti k fibrinu vede altepláza v dávce 100 mg k mírnému snížení hladin cirkulujícího fibrinogenu (na přibližně 60 % za 4 hodiny), které se typicky zvýší o více než 80 % za 24 hodin. Koncentrace plazminogenu a alfa-2-antiplazminu po 4 hodinách klesají na 20 % a 35 % původních hladin a po 24 hodinách se opět zvyšují na více než 80 %. Významný a dlouhodobý pokles hladiny cirkulujícího fibrinogenu byl pozorován pouze u malého počtu pacientů.

Farmakokinetika

Aktivizovat Rychle se vylučuje z krevního oběhu a metabolizuje se hlavně v játrech. Plazmatická clearance léčiva je 550-680 ml/min.

T 1/2 v α-fázi je 4-5 minut. To znamená, že po 20 minutách bude v plazmě méně než 10 % původního množství léčiva. Pro zbývající množství léčiva je T1/2 v β-fázi asi 40 minut.

Indikace

- trombolytická léčba akutního infarktu myokardu v prvních 6 hodinách po rozvoj symptomů(90minutový / zrychlený / dávkovací režim);

- trombolytická terapie akutního infarktu myokardu v době 6-12 hodin po rozvoji symptomů (3hodinový dávkovací režim);

- trombolytická terapie akutní masivní plicní embolie doprovázené nestabilní hemodynamikou, diagnóza by měla být pokud možno objektivně potvrzena (například plicní angiografie nebo neinvazivní metody, například plicní tomografie). Klinické studie týkající se mortality a dlouhodobých výsledků léčby plicní embolie nebyly provedeny;

- trombolytická léčba akutní ischemické cévní mozkové příhody (indikována pouze tehdy, je-li předepsána do 3 hodin po nástupu příznaků cévní mozkové příhody a je-li vyloučeno intrakraniální krvácení / hemoragická cévní mozková příhoda/ pomocí vhodných zobrazovacích metod, např. počítačová tomografie mozek).

Dávkovací režim

Aktivizovat by měl být použit co nejdříve po nástupu příznaků.

Na infarkt myokardu s 90minutovým (zrychleným) dávkovacím režimem pro pacienty, u kterých lze léčbu zahájit do 6 hodin od nástupu příznaků, lék je předepsán v dávce 15 mg IV bolus, poté 50 mg jako IV infuze během prvních 30 minut, následuje infuze 35 mg po dobu 60 minut, dokud není dosaženo maximální dávky 100 mg.

Dávka léku by měla být vypočtena v závislosti na tělesné hmotnosti. Zpočátku je lék předepsán v dávce 15 mg IV bolus, poté 750 mcg/kg tělesné hmotnosti (maximálně 50 mg) po dobu 30 minut IV kapáním, následuje infuze 500 mcg/kg (maximálně 35 mg) po dobu 60 minut.

Na infarkt myokardu s 3hodinovým dávkovacím režimem pro pacienty, u kterých lze léčbu zahájit mezi 6. a 12. hodinou po nástupu příznaků, lék je předepsán v dávce 10 mg IV bolus, poté 50 mg jako IV infuze během první hodiny, následuje IV infuze 10 mg po dobu 30 minut, dokud není dosaženo maximální dávky 100 mg během 3 hodin.

U pacientů s hmotností nižší než 65 kg celková dávka by neměla překročit 1,5 mg/kg.

Pomocná terapie: kyselina acetylsalicylová by měl být předepsán co nejdříve po propuknutí trombózy a pokračovat v něm během prvních měsíců po infarktu myokardu. Doporučená dávka je 160-300 mg/den. Současně by mělo být zahájeno užívání heparinu po dobu 24 hodin nebo déle (při zrychleném dávkovacím režimu - alespoň 48 hodin). Před zahájením trombolytické léčby se doporučuje zahájit intravenózní bolusovou aplikaci heparinu v dávce 5000 U/h. Následně je heparin podáván infuzí rychlostí 1000 jednotek/hodinu. Dávka heparinu by měla být upravena v závislosti na výsledcích opakovaného stanovení aPTT (hodnoty by měly 1,5-2,5krát překročit počáteční hladinu).

Na plicní embolie Aktivizovat podává se v celkové dávce 100 mg během 2 hodin.Největší zkušenosti byly získány při následujícím dávkovacím režimu: nejprve se lék předepisuje v dávce 10 mg iv bolus po dobu 1-2 minut, poté 90 mg iv v kapání přes 2 hodiny .U pacientů s hmotností nižší než 65 kg celková dávka by neměla překročit 1,5 mg/kg tělesné hmotnosti.

Pomocná terapie: po použití Aktivizovat Pokud je APTT nižší než 2násobek výchozí hodnoty, měl by být předepsán heparin (nebo pokračovat). Další infuze se také provádí pod kontrolou APTT, která by měla překročit počáteční hladinu 1,5-2,5krát.

Na akutní ischemická cévní mozková příhoda Doporučená dávka je 900 mcg/kg (maximálně 90 mg) ve formě intravenózní infuze během 60 minut po počáteční intravenózní bolusové injekci dávky léčiva ve výši 10 % celkové dávky. Terapie by měla být zahájena co nejdříve po nástupu příznaků (nejlépe do 3 hodin).

Pomocná terapie: Bezpečnost a účinnost výše uvedeného léčebného režimu, použitého v kombinaci s heparinem a kyselinou acetylsalicylovou během prvních 24 hodin po nástupu příznaků, nebyla dostatečně prozkoumána. V tomto ohledu v prvních 24 hodinách po zahájení terapie Aktivizovat je třeba se vyhnout použití kyseliny acetylsalicylové nebo intravenózního heparinu. Pokud je použití heparinu nutné z jiných indikací (například pro prevenci hluboké žilní trombózy), jeho dávka by neměla překročit 10 000 IU denně a lék se podává subkutánně.

Pravidla pro přípravu infuzního roztoku

Lyofilizovaný prášek obsažený v lahvičce (50 mg) se rozpustí za sterilních podmínek v 50 ml vody na injekci. Konečná koncentrace alteplázy je 1 mg/ml.

Výsledný roztok lze zředit sterilním fyziologickým roztokem (0,9 %) na minimální koncentrace altepláza 0,2 mg/ml.

Původně získaný roztok nelze ředit vodou pro injekce nebo infuzními roztoky na bázi sacharidů, například dextrózy.

Po naředění se výsledný roztok podává intravenózně, jak je popsáno výše.

Vedlejší účinek

Nejčastější vedlejší účinek je krvácení vedoucí ke snížení hematokritu a/nebo hemoglobinu.

Krvácení spojené s trombolytickou terapií lze rozdělit do dvou hlavních kategorií:

- vnější krvácení (obvykle z míst vpichu nebo poškození krevních cév);

- vnitřní krvácení z gastrointestinálního traktu, urogenitálního traktu, krvácení do retroperitoneálního prostoru, krvácení do mozku nebo krvácení z parenchymálních orgánů.

Níže uvedené údaje jsou založeny na výsledcích klinických studií Aktivizovat u 8299 pacientů s akutním infarktem myokardu.

Případ embolizace cholesterolovými krystaly, který nebyl pozorován v populaci klinické studie, je založen na izolované zprávě.

Ve srovnání se studiemi u infarktu myokardu byl počet pacientů s plicní embolií a cévní mozkovou příhodou, kteří se zúčastnili klinických studií (do 0-3 hodin od nástupu příznaků těchto onemocnění), velmi malý. Proto malé číselné rozdíly zaznamenané ve srovnání s údaji získanými při infarktu myokardu byly s největší pravděpodobností důsledkem malé velikosti vzorku. Kromě intrakraniálního krvácení (jako vedlejšího účinku u cévní mozkové příhody) a reperfuzních arytmií (jako vedlejšího účinku u infarktu myokardu) neexistuje žádný klinický důvod předpokládat kvalitativní a kvantitativní rozdíly ve spektru vedlejší efekty lék Aktivizovat v případě jeho použití při plicní embolii a akutní ischemické cévní mozkové příhodě nebo při infarktu myokardu.

Nežádoucí účinky zaznamenané při použití pro infarkt myokardu

Často: reperfuzní arytmie, které mohou být život ohrožující a vyžadují použití konvenční antiarytmické terapie.

Nežádoucí účinky zaznamenané při použití pro infarkt myokardu a plicní embolii

Zřídka: intrakraniální krvácení.

Nežádoucí účinky zaznamenané při použití u akutní ischemické cévní mozkové příhody

Často: intrakraniální krvácení. Hlavním nežádoucím účinkem bylo klinicky významné intrakraniální krvácení (jejich frekvence dosahovala 10 %). Nebylo však zjištěno žádné zvýšení míry komplikací ani celkové mortality.

Nežádoucí účinky zaznamenané při použití u infarktu myokardu, plicní embolie a akutní ischemické cévní mozkové příhody

Často: vnější krvácení, obvykle z míst vpichu nebo z poškozených cév, snížení krevního tlaku.

Často: gastrointestinální krvácení, nevolnost, zvracení (nevolnost a zvracení mohou být také příznaky infarktu myokardu), zvýšená tělesná teplota, krvácení z urogenitálního traktu, krvácení z nosu, ekchymóza.

Zřídka: krvácení v retroperitoneálním prostoru, krvácení z dásní, tromboembolismus, který může být doprovázen odpovídajícími následky na straně postižených vnitřní orgány. Byly pozorovány anafylaktoidní reakce (obvykle mírné, ale v některých případech mohou být život ohrožující); Možná vyrážka, kopřivka, bronchospasmus, angioedém, hypotenze, šok nebo jakákoli jiná alergická reakce. Pokud se tyto reakce rozvinou, je třeba použít konvenční antialergickou léčbu. Bylo zjištěno, že u relativně velké části pacientů s takovými reakcemi byly současně použity ACE inhibitory. Anafylaktické reakce(tj. kvůli IgE) pro Aktivizovat neznámý.

Zřídka: přechodná tvorba protilátek proti Aktivizovat (v nízkých titrech), ale klinický význam tohoto jevu nebyl stanoven; embolizace s krystaly cholesterolu, která může vést k odpovídajícím následkům z postižených vnitřních orgánů; krvácení z parenchymálních orgánů.

Často byly nutné krevní transfuze.

Kontraindikace

- hemoragická diatéza;

- významné krvácení v současnosti nebo během předchozích 6 měsíců;

— souběžné podávání perorální antikoagulancia, jako je warfarin (mezinárodní normalizovaný poměr >1,3);

- anamnéza onemocnění centrálního nervového systému (včetně novotvarů, aneuryzmat);

- operace na hlavě popř mícha;

- intrakraniální (včetně subarachnoidálního) krvácení aktuálně nebo v anamnéze;

— podezření na hemoragickou mrtvici;

- těžké nekontrolovatelné arteriální hypertenze;

- velký chirurgický zákrok nebo těžké trauma během předchozích 10 dnů (včetně jakéhokoli traumatu v kombinaci s tímto akutním infarktem myokardu);

- nedávné traumatické poranění mozku;

- prodloužená nebo traumatická kardiopulmonální resuscitace (více než 2 minuty), porod během předchozích 10 dnů;

- nedávné propíchnutí nestlačitelných krevních cév (například podklíčkové a krční žíly);

- hemoragická retinopatie (včetně diabetes mellitus), která může být indikována poruchou zraku;

- jiná hemoragická oční onemocnění;

- bakteriální endokarditida;

- perikarditida;

— akutní pankreatitida;

- potvrzený žaludeční vřed a duodenum během posledních 3 měsíců;

- závažná onemocnění jater, včetně selhání jater, cirhóza jater, portální hypertenze(S křečové žíly jícnové žíly), aktivní hepatitida;

- arteriální aneuryzmata, vrozené vady rozvoj tepen a žil;

- novotvary se zvýšeným rizikem krvácení;

- přecitlivělost na složky léku.

V případě použití léku k léčbě akutního infarktu myokardu a plicní embolie jsou kromě výše uvedených kontraindikací následující kontraindikace:

- anamnéza mrtvice.

Při použití léku k léčbě akutní ischemické cévní mozkové příhody existují kromě výše uvedených kontraindikací následující kontraindikace:

- nástup příznaků ischemické cévní mozkové příhody více než 3 hodiny před zahájením infuze nebo nedostatek přesných informací o době nástupu onemocnění;

- rychlé zlepšení akutní ischemické cévní mozkové příhody nebo mírných příznaků v době infuze;

- těžká cévní mozková příhoda, na základě klinických údajů (například pokud NIHSS>25) a/nebo podle výsledků vhodných zobrazovacích metod;

- křeče na začátku mrtvice;

- informace o utrpěl mrtvici nebo vážné poranění hlavy během předchozích 3 měsíců;

- výskyt předchozí mrtvice na pozadí diabetes mellitus;

- použití heparinu do 48 hodin před propuknutím cévní mozkové příhody, pokud je v té době zvýšený aktivovaný parciální trombinový čas (aPTT);

- použití protidestičkových látek v době infuze a 24 hodin po infuzi;

— počet krevních destiček nižší než 100 000/μl;

- systolický krevní tlak nad 185 mm Hg. Art., nebo diastolický krevní tlak nad 110 mm Hg. Art., nebo aplikace je nutná intenzivní péče(iv podávání léků) ke snížení krevního tlaku na tyto limity;

- hladina glukózy v krvi je nižší než 50 mg/dl nebo vyšší než 400 mg/dl.

Droga Aktivizovat není indikován k léčbě akutní cévní mozkové příhody u dětí a dospívajících do 18 let a u dospělých nad 80 let.

Použití během těhotenství a kojení

Klinická zkušenost Aktivizovat omezena během těhotenství a kojení. Otázka izolace alteplázy od mateřské mléko nestudoval.

V případě nutnosti použití léku (u onemocnění přímo ohrožujících život) během těhotenství a kojení je třeba posoudit očekávaný přínos terapie pro matku a potenciální riziko pro plod nebo kojence. V tomto ohledu použití Aktivizovat během těhotenství a během kojení Nedoporučeno.

Použití při dysfunkci jater

Lék je kontraindikován u závažných onemocnění jater, včetně jaterního selhání, jaterní cirhózy, portální hypertenze (s jícnovými varixy), aktivní hepatitidy.

speciální instrukce

V následující případy po domluvě Aktivizovat stupeň očekávaného přínosu a možné riziko krvácení je třeba pečlivě posoudit:

- nedávná intramuskulární injekce nebo menší nedávné zásahy, jako je biopsie, punkce velké nádoby, srdeční masáž při resuscitaci;

- onemocnění (neuvedená v seznamu kontraindikací), u kterých je zvýšené riziko krvácení.

Při léčbě akutního infarktu myokardu a akutní plicní embolie by měl být lék používán s opatrností:

- se systolickým krevním tlakem nad 160 mm Hg;

- ve stáří, kdy se může zvýšit riziko intrakraniálního krvácení. Vzhledem k tomu, že starší pacienti mají větší pravděpodobnost pozitivní výsledek tuto léčbu se také zvyšuje, je nutné pečlivé posouzení poměru přínos/riziko.

Při léčbě akutní ischemické cévní mozkové příhody by měl být lék používán s opatrností, protože aplikace Aktivizovat u této kategorie pacientů (ve srovnání s užíváním tohoto léku pro jiné indikace) je doprovázeno výrazně zvýšeným rizikem intrakraniálního krvácení, protože krvácení se vyskytuje převážně v nekrotické oblasti.

To je třeba vzít v úvahu zejména v následujících případech:

- všechny stavy uvedené v části „Kontraindikace“ a obecně všechny stavy charakterizované vysokým rizikem krvácení;

— přítomnost malých asymptomatických aneuryzmat mozkových cév;

- u pacientů, kteří byli dříve léčeni kyselinou acetylsalicylovou nebo jinými protidestičkovými léky, může být zvýšené riziko intracerebrálního krvácení, zvláště pokud Aktivizovat začal později. Vzhledem ke zvýšenému riziku mozkového krvácení by použitá dávka alteplázy neměla překročit 900 mcg/kg (maximální dávka je 90 mg).

Léčba by neměla být zahájena později než 3 hodiny po nástupu příznaků z důvodu nepříznivého poměru přínos/riziko v důsledku následujících okolností:

- pozitivní efekt léčby klesá s pozdním zahájením terapie;

- mortalita se zvyšuje hlavně u pacientů, kteří dříve užívali kyselinu acetylsalicylovou;

- zvýšené riziko krvácení.

Léčba Aktivizovat by měl provádět lékař se zkušenostmi s trombolytickou terapií a se schopností monitorovat její účinnost. Použitím Aktivizovat Doporučuje se mít k dispozici standardní resuscitační vybavení a vhodné léky.

Nejčastější komplikace terapie Aktivizovat krvácí. Současné užívání heparinu může podporovat krvácení. Protože Aktivizovat rozpouští fibrin, může dojít ke krvácení z nedávných míst vpichu. Proto trombolytická terapie vyžaduje pečlivé sledování oblastí možného krvácení (včetně míst zavedení katétru, arteriálních a venózních punkcí, řezů a injekcí). Během léčby je třeba se vyvarovat použití pevných katétrů, intramuskulárních injekcí a zbytečných manipulací. Aktivizovat .

V případě závažného krvácení, zejména krvácení do mozku, je třeba okamžitě ukončit fibrinolytickou terapii, stejně jako použití heparinu. Pokud byl heparin použit během 4 hodin před začátkem krvácení, je třeba zvážit vhodnost použití protaminu. V ve vzácných případech Pokud jsou výše uvedená konzervativní opatření neúčinná, může být indikováno použití krevních produktů. Transfuzní podání kryoprecipitátu, čerstvě zmrazené plazmy a krevních destiček lze předepsat v souladu s klinickými a laboratorními parametry, stanovovanými opakovaně po každém podání. Je vhodné provádět infuzi kryoprecipitátu, dokud koncentrace fibrinogenu nedosáhne 1 g/l. Mohou být zvážena antifibrinolytika (např. kyselina tranexamová), ale specifické studie nebyly provedeny.

V případě akutního infarktu myokardu a plicní embolie by se neměl používat. Aktivizovat v dávce přesahující 100 mg a v případě akutní ischemické cévní mozkové příhody - v dávce přesahující 90 mg, protože zvyšuje se riziko intrakraniálního krvácení.

Po dokončení léčby nebyla pozorována trvalá tvorba protilátek proti rekombinantnímu lidskému tkáňovému aktivátoru plazminogenu. Systematizované zkušenosti s opětovným použitím Aktivizovat není dostupný. Pokud se objeví anafylaktoidní reakce, infuze by měla být zastavena a měla by být podána vhodná léčba. Doporučuje se pravidelné sledování snášenlivosti léčby, zvláště u pacientů užívajících současně ACE inhibitory.

Při léčbě akutního infarktu myokardu je třeba mít navíc na paměti následující opatření:

- koronární trombolýza může vést k arytmii spojené s reperfuzí;

— nejsou žádné zkušenosti s použitím antagonistů glykoproteinu IIb/IIIa během prvních 24 hodin po zahájení léčby;

- použití trombolytických látek může zvýšit riziko tromboembolie u pacientů s trombózou levého srdce, například s mitrální stenózou nebo fibrilací síní.

Při léčbě akutní ischemické cévní mozkové příhody je třeba mít navíc na paměti následující opatření.

Léčba by měla být prováděna výhradně zkušeným lékařem se schopnostmi a zkušenostmi v poskytování intenzivní neurologické péče na specializovaném oddělení, které má schopnost provádět celou škálu neurozobrazovacích studií.

Během léčby a 24 hodin po jejím ukončení je nutné monitorovat krevní tlak. Při zvýšení systolického krevního tlaku nad 180 mm Hg. nebo diastolický krevní tlak pod 105 mm Hg. Doporučuje se IV použití antihypertenziv.

Terapeutický účinek je snížen u pacientů, kteří dříve prodělali cévní mozkovou příhodu nebo v přítomnosti nekontrolovaného diabetes mellitus. U takových pacientů je poměr přínos/riziko považován za méně příznivý, i když stále zůstává pozitivní. U pacientů s velmi lehkými cévními mozkovými příhodami riziko převyšuje očekávaný přínos, proto používejte Aktivizovat Nedoporučeno.

Pacienti s velmi těžkou cévní mozkovou příhodou mají zvýšené riziko intrakraniálního krvácení a úmrtí. V těchto případech Aktivizovat by se nemělo používat.

Pacienti s rozsáhlými mozkovými infarkty mají zvýšené riziko nepříznivého výsledku vč. těžké intracerebrální krvácení a smrt. V takových případech je třeba pečlivě zvážit rizika a přínosy terapie.

V případě cévní mozkové příhody se pravděpodobnost příznivého výsledku léčby snižuje s rostoucím věkem, stejně jako s rostoucí závažností cévní mozkové příhody a s zvýšené hladiny glukóza v krvi. Pravděpodobnost vážného postižení a úmrtí nebo závažného intrakraniálního krvácení se však zvyšuje bez ohledu na léčbu. Aktivizovat by neměl být používán u pacientů starších 80 let, v případech těžké cévní mozkové příhody (jak bylo stanoveno klinickými nálezy a/nebo zobrazovacími studiemi) a v případech, kdy jsou výchozí hodnoty glukózy v krvi nižší než 50 mg/dl nebo vyšší než 400 mg/dl.

Reperfuze ischemické oblasti může vést k mozkovému edému v infarktové oblasti. Vzhledem ke zvýšenému riziku krvácení by inhibitory agregace krevních destiček neměly být zahájeny během prvních 24 hodin po trombolýze alteplázou.

Použití v pediatrii

Aktuálně zkušenosti s Aktivizovat omezené u dětí.

Předávkovat

Příznaky: I přes relativní specifitu pro fibrin může předávkování způsobit klinicky významný pokles fibrinogenu a koagulačních faktorů.

Léčba: ve většině případů stačí vyčkávací přístup s očekáváním fyziologické regenerace těchto faktorů po ukončení podávání Aktivizovat . Pokud dojde k závažnému krvácení, doporučuje se transfuze čerstvé zmrazené plazmy nebo čerstvé plné krve a v případě potřeby lze předepsat syntetická antifibrinolytika.

Drogové interakce

Speciální interakční studie Aktivizovat nebyl testován s jinými léky běžně používanými u akutního infarktu myokardu.

Užívání léků, které ovlivňují srážlivost krve nebo mění funkci krevních destiček před zahájením léčby, během ní nebo po jejím zahájení Aktivizovat může zvýšit riziko krvácení.

Současné užívání ACE inhibitorů může zvýšit riziko anafylaktoidních reakcí. Tyto reakce byly pozorovány u relativně velké části pacientů užívajících ACE inhibitory.

Farmaceutické interakce

Droga Aktivizovat se nesmí míchat s jinými léky (ani heparinem), a to ani v infuzní lahvi ani v ní společný systém pro intravenózní podání.

Podmínky pro výdej z lékáren

Lék je dostupný na lékařský předpis.

Podmínky a lhůty skladování

Lék by měl být uchováván na místě chráněném před světlem, mimo dosah dětí, při teplotě do 25°C. Doba použitelnosti - 3 roky.

Připravený roztok lze uchovávat v chladničce až 24 hodin; při teplotě nepřesahující 25°C - až 8 hodin.

Aktivátor tkáňového plazminogenu je protein patřící do skupiny sekretovaných proteáz. Převádí plazminogen na aktivní forma– plasmin.

Altepláza (actylise)– rekombinantní lidský tkáňový aktivátor plazminogenu

Lyofilizovaný prášek pro přípravu roztoku: 50 mg v lahvičce s rozpouštědlem (100 ml).

Vzhledem k nedostatku antigenicity jej lze podávat opakovaně, a to i po předchozí léčbě streptokinázou, a má vysoký tropismus pro trombofibrin.

Standardní režim podávání: bolusové podání 15 mg léčiva, následované kapací infuzí 50 mg během 30 minut a 35 mg během další hodiny.

Reteplase- trombolytikum třetí generace. Poločas léku je výrazně delší ve srovnání s jeho předchůdci, což umožňuje jeho intravenózní podání ve dvou dávkách (10 IU s odstupem 30 minut).

Tenecteplase (metalise)- trombolytikum třetí generace.

Má vysokou selektivitu, zvýšenou odolnost vůči plazminogenovému antiaktivátoru-1 a dlouhý poločas. Díky těmto vlastnostem může být tenektepláza podávána jako jeden bolus. Dávka tenekteplasy závisí na hmotnosti a je asi 30-50 mg (0,53 mg/kg).

Vzhledem k možnosti bolusového podání je vhodné užívat lék pro přednemocničním stádiu(zlatý standard přednemocniční trombolýzy).

Indikace pro trombolýzu:

1. EKG odhalí vzestup ST intervalu o více než 1 mm ve dvou nebo více sousedních svodech (ve V 1-3 je vzestup ST více než 2 mm) nebo přítomnost akutní blokády levého raménka raménka (pravděpodobně když subtotální uzávěr koronární tepny progreduje do totální), nebo idioventrikulární rytmus.

2. Prvních 6 hodin infarktu myokardu.

3. Prvních 12 hodin infarktu myokardu s přetrvávající bolestí, elevací ST segmentu a absencí vlny Q, pokud infarkt myokardu není kompletní a je zde „mozaika“ klinický obraz Rozhodnutí o provedení trombolýzy po 12 hodinách se provádí na základě klinického obrazu, anamnézy a EKG.

Kontraindikace trombolýzy:

Absolutní:

· Předchozí hemoragická mrtvice.

· Strukturální cerebrální vaskulární léze (arteriovenózní malformace)

· Maligní nádory mozku (primární nebo metastatické).

· Ischemická cévní mozková příhoda během předchozích 3 měsíců.

· Podezření na disekující aneuryzma aorty.

· Akutní krvácení nebo hemoragická diatéza.

· Traumatické poranění mozku nebo neurochirurgický zásah na mozku nebo míše popř oblast obličeje lebky během předchozích 3 měsíců.

· Alergické reakce anamnéza trombolytické léčby.

Relativní

Těžká, špatně kontrolovaná hypertenze v anamnéze

· Těžká nekontrolovaná arteriální hypertenze při přijetí (TK vyšší než 180/110 mmHg).

· Porušení cerebrální cirkulace před více než 3 měsíci demence nebo intrakraniální patologie neuvedené v absolutních kontraindikacích.

· Užívání nepřímých antikoagulancií s vysokým INR (3-4).

· Dlouhé (více než 10 minut) vedení resuscitační opatření během předchozích 3 týdnů.

· Chirurgická intervence během předchozích 3 týdnů.

· Vnitřní krvácení před 2-4 týdny.

· Těhotenství.

· Peptický vředžaludku nebo dvanáctníku v akutní fázi.

· Závažná onemocnění jater.

Kritéria účinnosti koronární reperfuze

Angiografické:

Stupeň 0 – neprokrvení: kontrastní látka neprochází pod místem trombózy;

I. stupeň – minimální průtok krve: kontrastní látka částečně proniká pod místo uzávěru, ale nevyplňuje koronární řečiště;

II stupeň - částečný průtok krve: kontrastní látka prochází místem okluze, plní koronární tepny, ale pomaleji než u normálních plavidel;

III stupeň - úplné obnovení průchodnosti: kontrastní látka vyplňuje a uvolňuje koronární tepnu stejnou rychlostí jako nad místem uzávěru.

Neinvazivní:

Rychlá dynamika úseku ST: pokles úseku ST ve svodu s největším vzestupem o 50 % a více po 1,5 hodině od zahájení trombolýzy.

Poruchy reperfuzního rytmu. Za nejvíce vypovídající je považován zrychlený idioventrikulární rytmus a pozdní komorové extrasystoly do 2-3 hodin od zahájení trombolýzy.

Rychlá dynamika biochemických markerů nekrózy. Za biochemická kritéria pro reperfuzi se považuje mnohonásobné zvýšení hladiny markerů nekrózy v krvi 90-120 minut od zahájení trombolýzy (fenomén „vymytí“) s dosažením maximálních hladin celkové CPK do 12 hodin, CPK-MB - do 6 hodin, myoglobin - do 3 hodin od začátku trombolýzy.

Rychlé snížení intenzity nebo úplná úleva syndrom bolesti do 60. minuty od zahájení trombolýzy.

NĚKTERÉ ASPEKTY LÉKOVÁNÍ

LÉČBA PACIENTŮ V AKUTNÍM OBDOBÍ

INFARKT MYOKARDU

Léky, předepisované během ischemie, snižují spotřebu kyslíku myokardem (snižují srdeční frekvenci, krevní tlak a kontraktilitu levé komory) a/nebo způsobují vazodilataci.

terapie β-blokátory

Hlavní mechanismy účinku β-blokátorů jsou:

Antihypertenzní účinek. Souvisí s inhibicí sekrece reninu a tvorby angiotenzinu II, blokádou presynaptických β-adrenergních receptorů, které zvyšují uvolňování norepinefrinu ze sympatických nervových zakončení, a snížením centrální vazomotorické aktivity. K poklesu produkce reninu, ale i angiotenzinu II a aldosteronu dochází také blokádou β1-adrenergních receptorů v juxtaglomerulárním aparátu ledvin.

Antiischemický účinek. Betablokátory snižují spotřebu kyslíku myokardem snížením srdeční frekvence, kontraktility myokardu a systolického tlaku krevní tlak. Navíc prodloužení diastoly způsobené snížením srdeční frekvence může zajistit zvýšení perfuze myokardu.

Antiarytmický účinek. Výsledek přímých elektrofyziologických účinků na srdce (snížení tepové frekvence, pokles spontánních impulsů ektopických kardiostimulátorů, zpomalení vedení a zvýšení refrakterní periody atrioventrikulárního uzlu) vede k poklesu sympatických vlivů a ischemie myokardu, zlepšení funkce baroreflexu a prevence hypokalemie vyvolané katecholaminy.

Dochází ke zlepšení koronárního průtoku krve v důsledku prodloužení diastoly. Zlepšení metabolismu myokardu - v důsledku inhibice katecholaminů indukovaného uvolňování volných mastné kyseliny z tukové tkáně; obnovení citlivosti β-adrenergních receptorů; snížení oxidačního stresu v myokardu.

Betablokátory se liší rozpustností ve vodě a lipidech. Produkty rozpustné v tucích(propranolol, metoprolol, oxprenolol, bisoprolol) se snadno vstřebávají do gastrointestinální trakt, jsou rychle metabolizovány v játrech, mají velké distribuční objemy a dobře pronikají hematoencefalickou bariérou. Naproti tomu ve vodě rozpustné β-blokátory (acebutolol, atenolol, betaxolol, carteolol, esmolol, nadolol, sotalol) se hůře vstřebávají, metabolizují se pomaleji a mají delší poločas. Proto lze léky rozpustné ve vodě užívat jednou denně.

Při poruše jaterních funkcí se prodlužuje poločas β-blokátorů rozpustných v tucích, při poruše funkce ledvin se prodlužuje poločas ve vodě rozpustných. To je základem pro volbu léků této skupiny u pacientů s jaterním a ledvinovým selháním.

S nestabilní hemodynamikou(vysoké riziko špatně kontrolovaného krevního tlaku, např. v akutních nebo akutních obdobích infarktu myokardu) je racionální používat krátkodobě působící betablokátory, které umožňují kontrolu klinické projevy nemocí.

Tab. Anaprilini 20 mg 1 tableta 3-4x denně.

Sol. Anaprilini 0,25% roztok 1 ml (2,5 mg) ředěný 1:10 v 0,9% roztoku NaCl intravenózně pomalu po frakcích, počínaje 1 mg, poté v závislosti na účinku a snášenlivosti zvýšením dávky na 5-10 mg.

Se stabilní hemodynamikou v akutním období infarktu myokardu se doporučuje předepisovat dlouhodobě působící betablokátory podle následujícího schématu:

Sol. Metoprolol 0,1% 5 ml (5 mg) zředěný 1:10 v 0,9% roztoku NaCl intravenózně pomalu ve frakčních krocích během 2 minut; opakujte 5 mg po 5 minutách; dalších 5 mg – po dalších 5 minutách; 15 minut po poslední dávce 25-50 mg perorálně každých 12 hodin.

V akutním a subakutním období infarktu myokardu se používají následující dlouhodobě působící β-blokátory.

Tab. Atenololi 25 mg (50 mg) 1 tableta 1krát denně.

Tab. Bisoprololi 2,5 mg (5 mg, 10 mg) 1 tableta 1krát denně.

Tab. Nebivololi 5 mg 1 tableta 1krát denně.

V případech, kdy jsou kontraindikace použití β-blokátorů, je indikováno předepisování nedihydropyridinových antagonistů kalcia. Jediný antagonista vápníku, který je považován za bezpečný u pacientů s infarktem myokardu, je nisoldipin.

Tab. Nisoldipini 5 mg (10 mg) 1 tableta 2krát denně.

A je důležitou součástí systému fibrinolýzy. Aktivátor plazminogenu je jedním z enzymů, které se nejčastěji účastní procesů destrukce bazální membrány, extracelulární matrix a buněčné invaze. Je produkován endotelem a je lokalizován v cévní stěně [Loscalso, ea 1988]. Tkáňový faktor je fosfolipoprotein. Apoprotein tohoto komplexu je integrální membránový glykoprotein s molekulami. o hmotnosti asi 46 kDa, která je těsně spojena s fosfolipidy membrán endoteliálních buněk, buněk hladkého svalstva a monocytů. TPA je syntetizován in vivo jako jednořetězcový polypeptid (molekulová hmotnost 72 kDa), který je přeměněn na dvouřetězcovou formu proteolýzou různými proteinázami, včetně plasminu, tkáňového kalikreinu a aktivovaného faktoru X. Dvouřetězcová forma tPA je aktivnější než jednořetězcový prekurzor. Optimální pH pro působení enzymu při konverzi angiotenzinogenu na Ang II je v kyselé oblasti. Viz tPA jako enzym tvořící ang II. TPA, měřená v krvi, je endoteliální aktivátor uvolňovaný do krevního oběhu pod vlivem různých podnětů. Koncentrace tPA v krvi je 6,6+/-2,9 ng/ml.

Tkáňový faktor, transmembránový glykoprotein, je členem rodiny cytokinových receptorů třídy II a může způsobit aktivaci buněk dvěma mechanismy.

Tkáňový faktor, iniciátor aktivace mechanismu vnějšího srážení krve, lokalizovaný v buňkách endotelu a hladkého svalstva, se při poškození dostává do kontaktu s krví, což v konečném důsledku přispívá k tvorbě trombinu a iniciaci mechanismu srážení krve. Má vysokou afinitu k f.VII cirkulujícímu v krvi. V přítomnosti Ca++ iontů se apoprotein T.f. tvoří stechiometrický komplex s f.VII, což způsobuje jeho konformační změny a převádí ho na serinovou proteinázu f.VIIa štěpením peptidové vazby Arg-152-Ile. Reakce je stimulována stopovým množstvím proteináz cirkulujících v krvi (f.Xa, trombin, f.VIIa, f.IXa). Výsledný komplex (f.VIIa-T.f.) převádí f.X na serinovou proteinázu f.Xa. Komplex tkáňový faktor-faktor VII je schopen aktivovat jak faktor X, tak faktor IX, což nakonec podporuje tvorbu trombinu a [Boyle, E.M., Verrier, E.D., ea., (1996)].

V proteinové struktuře T.f. Rozlišují se tři domény: hlavní, lokalizovaná na povrchu buněčné membrány, transmembránová a cytoplazmatická. Povrchová doména obsahující 219 aminokyselinových zbytků Ser-1-Glu-219 má receptorové funkce. Za 23člennou transmembránovou doménou následuje cytoplazmatický „ocásek“, s jehož pomocí je protein připevněn k membráně. Zde je realizována schopnost jediného Cys zbytku této domény tvořit thioesterovou vazbu s membránovými lipidy (palmitát nebo stearát). Určitá role je přisuzována alifatickým aminokyselinovým zbytkům, s jejichž pomocí je protein integrován do vnitřní vrstvy membrány, čímž se zvyšuje „ukotvení“ molekuly tkáňového faktoru. Povrchová doména je glykosylována na třech threoninových zbytcích (Thr-13, Thr-126, Thr-139). Obsahuje 4 zbytky Cys, které tvoří dvě disulfidové vazby, jednu v N-konci a druhou v C-koncové oblasti domény. Tyto vazby stabilizují odpovídající peptidové smyčky. Ukázalo se, že disulfidová vazba lokalizovaná v C-terminální oblasti je funkčně významná, právě její účast je nezbytná pro manifestaci kofaktorových funkcí tkáňového faktoru ve vztahu k faktorům VII a VIIa. Na základě analýzy primární struktury, umístění disulfidových vazeb a studia funkčních znaků byla odhalena jeho homologie s interferony Ifn-alphaR a Ifn-gammaR z rodiny cytokinových receptorů II. třídy. V krevním koagulačním systému interakce faktorů VII/VIIa s receptorem - kofaktorem - tkáňovým faktorem urychluje aktivaci zevního hemokoagulačního mechanismu několik tisíckrát. Tohoto zrychlení je dosaženo:

Jednak proteolytickým mechanismem, iniciovaným tvorbou komplexu tkáňového faktoru s faktorem VII/VIIa (VII aktivní) krevní koagulace, ve kterém tkáňový faktor funguje jako kofaktor a modulátor faktoru VII/VIIa. Vazba faktoru VIIa na tkáňový faktor způsobuje zvýšení intracelulární Ca2+ fosforylace mitogenem aktivovaných proteinkináz (MAP kináz) - Erk-1, Erk-2, p38, Jnk a vede k transkripci genu Egr-1 (časný růst reakce), obvykle vyvolané cytokiny a faktory růstu.

Za druhé, neproteolytickým mechanismem, kdy se samotná cytoplazmatická doména tkáňového faktoru účastní intracelulární signalizace, což vede k

Vynález se týká nového zlepšeného tkáňově aktivního plasminogenu (vylepšený TPA), s prodlouženým poločasem rozpadu v těle a zvýšenou stabilitou vůči teplu a kyselinám, který může být použit k potlačení zánětu v oblasti trombózy. Vynález se také týká způsobu výroby uvedeného tkáňového aktivátoru plasminogenu za použití technologie rekombinantní DNA a prostředků použitých pro jeho implementaci. Je známo, že lidský tkáňový aktivátor plazminogenu (TPA) má příznivou fibrinolytickou aktivitu a je extrémně účinný proti plazminogenu vázanému na fibrin, zatímco neaktivuje plazminogen ve fázi volného oběhu v těle tak účinně jako konvenční trombolytická činidla, streptokináza (SK ) a urokináza (UK). Aminokyselinová sekvence lidského APT a nukleotidová sekvence cDNA kódující lidský APT jsou známé (Pennica. D. a kol., Nature, 301, 214-221, 1983). Je také známo, že lidský APT rozpouští žilní a arteriální krevní sraženiny. Velké klinické studie ukazují, že lidský APT podávaný intravenózně je účinný při reperfuzi uzavřené koronární arterie u pacienta s akutním infarktem myokardu. Nevýhodou použití tohoto léku při léčbě onemocnění spojeného s tvorbou trombu je však extrémně krátký poločas jeho enzymatické aktivity v krvi (Rijken, D.C., et al., Thromb. Heamost. 54 (1), 61, 1985, Hubert, E. F. a kol., Blood, 65, 539, 1985). Při použití k léčbě musí být lidský APT podáván jako kontinuální intravenózní injekce s vysoká dávka. Je známo, že přirozeně se vyskytující lidský APT má doménovou strukturu, počínaje N-koncem molekuly je fingerdoména, doména EGF (epidermální růstový faktor), dvě domény „kringle 1“ a „kringle 2“ a serin proteázový domer. V práci Rijkena a kol. je uvedeno (Rijken D.C. a kol., Thromb. Heamost., 54 (1), 61, 1985), že krátký biologický poločas lidského APT může souviset se všemi doménami. lidského APT, kromě serinových doménových proteáz. Práce Zonnevelda a kol. (Zonneveld, A.J.V., et al, Proč. Natl. Acad. USA., 83, 4670, 1986) také poznamenává, že prstová doména, EFR doména a kringle 2 doména mohou mít Důležité pro fibrin-vazebnou aktivitu přirozeně se vyskytujícího lidského APT, stejně jako pro udržení fibrin-dependentní aktivace APT. Dosud však nebyla vyvinuta žádná specifická opatření k udržení fibrin-vazebné aktivity přirozeně se vyskytujícího lidského APT a jeho fibrin-dependentní aktivity, stejně jako k prodloužení biologického poločasu. Publikovaná japonská patentová přihláška č. 48378/1987 popisuje APT získaný delecí aminokyselin 87-175 přirozeně se vyskytujícího lidského APT, ve kterém je deletován "kringle 1". Tento APT se vyznačuje další indukovanou bodovou mutací v oblasti epidermálního růstového faktoru. Japonská patentová přihláška uvádí, že modifikovaný APT má schopnost vázat se na fibrin, ale interakce s inhibitorem tkáňového aktivátoru plasminogenu je oslabena. Evropský patent č. 241208 popisuje APT získaný delecí aminokyselin 92-179 přirozeně se vyskytujícího lidského APT, ve kterém je také deletován kringle 1. Tato práce uvádí, že tento APT má fibrinolytickou aktivitu. Kromě toho evropský patent č. 231624 popisuje modifikovaný APT s prodlouženým poločasem rozpadu. Modifikovaný APT, který má sekvenci F-EGFK2-A, postrádá doménu kringle 1, ale není uveden žádný specifický způsob jeho přípravy. Ve světle výše uvedeného je jasné, že modifikovaný APT podle vynálezu se musí lišit od přirozeně se vyskytujícího APT v aminokyselinové sekvenci v oblasti vnitřních domén. V důsledku rozsáhlého výzkumu získal žadatel vylepšený APT, který obsahuje doménu prstu, doménu EFR, doménu kringle 2 a doménu serinové proteázy, ale první doména „kringle 1“ je odstraněna na konkrétním místě, a v místě vazby domény byla zavedena kringle 2 a mutace serinové proteázy, což má za následek zlepšený APT, který vykazuje vynikající odolnost vůči teplu a kyselinám, výrazně prodloužený biologický poločas a významnou protizánětlivou aktivitu, přičemž si zachovává požadované vlastnosti přirozeně se vyskytující lidský APT. Vynález se týká zlepšeného APT. APT podle vynálezu se výrazně liší svou chemickou strukturou od přirozeně se vyskytujícího lidského APT a vykazuje vynikající vlastnosti. Zlepšený APT v souladu s vynálezem je polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci reprezentovanou obecný vzorec 28-29, kde R je přímá vazba, Y je A-Ile-B (A je Arg nebo Glu a B je lys nebo Ile), výhodně Glu-Jle-Lys. H2N označuje amino-konec a -COOH označuje karboxy-konec). Ve vynálezu se termín "vylepšený APT" používá k označení analogu APT, ve kterém A a B představují aminokyseliny popsané níže, v tomto pořadí:

Vylepšený APT (II): Arg, Lys;

Advanced APT (V): Arg, Ile;

Advanced APT (VI): Glu, Lys;

Vylepšený APT (VIII): Glu, Ile. Vynález je také zaměřen na expresi navrhovaného analogu APT pomocí technik rekombinantní DNA. S tím jsou spojeny nové DNA kódující zlepšené expresní vektory APT a rekombinantní DNA. Obrázky 1, 2 ukazují sekvenci 16 oligodeoxynukleotidů použitých ke konstrukci fragmentu syntetického genu kódujícího zlepšený APT (II); na obr. 3 - 4 - fragment syntetického genu pro konstrukci vylepšeného APT (II) podle vynálezu, obsahující konce restrikčních enzymů Bge 11 a Eco R1, který je zkonstruován pomocí 16 oligodeoxynukleotidů znázorněných na obr. 1 - 2 ; Obr. 5 - způsob konstrukce vylepšeného APT (II) (na obrázku černá plocha, stínovaná plocha a nešrafovaná plocha označují oblast kódující zralý protein APT, oblast kódující propropeptid a nepřekládanou oblast; Obr. 6 - metoda testování fragmentu syntetického genového bloku IV stanovením sekvence bází DNA pomocí dideoxy metody a metody 7-DEAZA, obr. 7 - metoda konstrukce expresního vektoru pVY1 v živočišných buňkách a integrace DNA vylepšeného APT na pVY1, obr. 8 - 13 DNA sekvence kódující vylepšený APT (II) a vylepšený APT (V), obr. 14 - 19 - aminokyselinové sekvence odvozené od sekvencí DNA kódujících vylepšený APT (II) a vylepšené APT (V), obr. 20 - restrikční enzymy a funkční mapa plazmidu pTPA 2, který má fragment Eco R1-Xho (asi 1000 párů bází) přirozeného genu APT, integrovaný do vektoru pBR322 v místě štěpení Eco R1 a Bam H1 stránky; Obrázek 21 - mp9 (vylepšený APT (II), mající fragment BgL11-Xho 11 (asi 1500 párů bází) genu, vylepšený APT (II) integrovaný do dvouvláknové DNA M13 mp9 v místě štěpení BamH1; Obr. 22 - závislost "dávka-účinek" pro aktivitu APT zlepšeného APT (VI) a přirozeně se vyskytujícího APT pomocí metody S-2251 v přítomnosti (+Fb) a nepřítomnosti (-Fb) fibrinového substituentu; 23 - změna aktivity vylepšeného APT (VI) a nativního APT v krvi králíka v průběhu času, Obr. 24 - změna zbytkové aktivity vylepšeného APT (VI) po tepelném zpracování Obr. lymfocyty aktivující faktor (LAF) zlepšeným APT (VI), obr. 26 - aktivace s použitím denaturovaného proteinu zlepšeného pomocí APT (VI); 27 - degradace denaturovaného proteinu pod vlivem zlepšeného APT (VI). Způsob získání rekombinantní DNA a transformovaných buněk je podrobně popsán níže. Způsob získání zlepšeného APT. Gen kódující přirozený APT, ze kterého je APT podle předkládaného vynálezu odvozen, je izolován z banky cDNA připravené z buněk Bowesova lidského melanomu. Poly A+ RNA byla izolována z lidských buněk Bowesova melanomu a frakcionována centrifugací s gradientem hustoty sacharózy. Potom se vybere malé množství frakcionované poly(A) + RNA a mRNA frakce kódující gen APT se identifikuje tečkovou hybridizací za použití oligonukleotidové sondy schopné rozpoznat specifickou sekvenci mRNA APT. Za použití této frakce bohaté na APT mRNA jako výchozího materiálu se připraví banka cDNA a provede se screening pomocí identifikační sondy APT mRNA popsané výše. Protože nebyl izolován jediný klon, který by měl úplnou sekvenci genu APT, chybějící sekvence bází se syntetizuje pomocí syntetizéru DNA, aby se získal požadovaný gen. Požadovaný gen je pak konstruován indukcí místně specifické mutace. Fragment Eco R1-Xho 11 se přirozeně vyskytuje v genu APT (asi 1000 párů bází), jehož část je deletována na N= konci, zavedena do vektoru pBR332 v místech štěpení Eco R1 a BamH1, což vede k pTPA2. Kmen (E. coli HB 101/pTPA2) získaný transformací E. coli tímto plazmidem byl uložen ve Fermentation Research Institute of Industrial Science and Technology Agency of Japan pod registračním číslem P-9649 (FERM BP-2107). Restrikční a funkční mapa plazmidu pTPA2 je ukázána na obr. 20. Vylepšený gen APT je vložen do plazmidu pVY1. Plazmid pVY1 byl připraven ligací fragmentu BamH1-Kpn1 (asi 2900 párů bází) plazmidu pRSV10 (vyrobeno Fine Chemicals) s fragmentem z Eco R1 štěpení plazmidu pAdD26SV (A) N 3 (N) (získaného od Dr. Hiroshi Handa z University of Tokyo (po obdržení na obou tupých koncích. V souladu s tím tento vektor obsahuje cDNA myšího genu dihydrofolát reduktázy pod transkripční kontrolou hlavního adenovirového pozdního promotoru (Ad2), časného promotoru SV 40 upstream od místa inzerce vylepšeného genu APT a intron a polyadenylační sekvence umístěné po směru genu podle vynálezu mohou být vloženy do jiného vhodného expresního vektoru. Expresní vektor je dále zaveden do vhodné hostitelské buňky, aby se získaly transformanty. Jako hostitelské buňky mohou být použity prokaryotické buňky, jako je E. coli, Bacillus subtilis atd., eukaryotické mikroorganismy, jako jsou kvasinky atd., a buňky vyšších živočichů. Jako zástupce E. coli se obvykle používá kmen JM109, kmen W3110, Q atd. patřící do kmene K12 a kmen BD170, kmen BR151 atd. se používají jako zástupci Bacillus subtilis. Z kvasnic lze použít kmen RH218, kmen SHY1 atd. kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Pro expresi se typicky používá plazmidový vektor nebo fágový vektor obsahující replikon odvozený od druhu kompatibilního s hostitelskými buňkami a regulační sekvenci. Příklady vektoru pro E. coli jsou například plazmidy pBR322, pUC18, pUC19 atd., fág, například qt, Charon 4A atd., fág M13 atd. pUB110 může být použit jako vektor pro Bacillus subtilis pSA2100 atd. a YRp7, YEp61 atd. mohou být použity jako vektor pro kvasinky. Vektor musí nést promotor schopný exprimovat požadovaný protein. Jako promotor pro gen E. coli nebo fágový gen lze použít například Lae, trp, tac, trc, pL atd. Jako hostitel jsou kultivované živočišné buňky, jako jsou buňky ledvin opice rhesus, buňky larev komára, ledvinové buňky africké opice zelené, buňky myšího fetálního fibroblastu, buňky vaječníků čínského křečka, buňky ledvin lidského plodu, buňky tkáně motýlího vajíčka, buňky podobné lidskému cervikálnímu epitelu mohou být použity buňky, lidské myelomové buňky, myší fibroblasty a tak dále. Jako vektor můžete použít časný promotor SV40, pozdní promotor SV40, SV40 nesoucí promotor z eukaryotického genu (například gen pro ptačí ovalbumin indukovatelný estrogenem, gen pro interferon, gen tyrosinaminotransferázy indukovatelný glukokortikoidy, gen thymidinkinázy, časný gen a pozdní adenovirové geny, gen fosfoglycerát kinázy, gen faktoru atd.), bovinní papilloma virus nebo vektory z nich odvozené. Kromě toho je známo, že APT secernované a produkované buňkami mají různé N-konce v závislosti na rozdílech v místech štěpení. V případě sekrece a produkce APT za použití kultivačních buněk jako hostitele se způsob štěpení signální peptidázou nebo proteázou liší v závislosti na typu buňky, takže lze získat druhy APT s různými N-koncemi. Tento jev není vhodný pouze pro případ sekrece a produkce pomocí kultivačních buněk, protože se předpokládá, že k podobnému jevu může dojít také při získávání APT prostřednictvím E. coli, Bacillus sublitis, kvasinek a dalších buněk podrobených speciální modifikaci. Pro transformaci hostitele pomocí expresního vektoru s integrovaným vylepšeným genem APT lze v případě E. coli použít metodu Hanahana, Hanahana, D.J.Mol. Biol., 166, 557, 1983), v případě manipulace s živočišnými buňkami lze použít metodu fosforečnanu vápenatého (Vander Eb, A. J. a Graham, F. L., Method in Enrymoloqy, 65, 826, 1980, Academic Press) a již brzy. Jak je popsáno výše, vylepšený APT je užitečný pro léčbu různých získaných onemocnění, včetně vaskulární koagulace (dokonce i hluboká žíla), plicní embolie, periferní arteriální trombóza, embolie v důsledku poškození srdce nebo periferních tepen, akutní infarkt myokardu a trombotický záchvat. Jako přirozeně se vyskytující lidský APT je vylepšený APT zvláště vhodný pro léčbu akutního infarktu myokardu. Přirozeně se vyskytující lidský APT se nedávno ukázal jako účinný při rozpouštění trombu uzavírajícího koronární arterii, regeneraci myokardiální perfuze a obnově většiny částí v ischemické myokardiální vrstvě, když je podáván intravenózně v dávce 30 až 70 mg po dobu 1 až 3 hodin. Zlepšený APT má prodloužený biologický poločas v krvi a je proto účinný ve stejných případech jako přirozeně se vyskytující lidský APT. Očekává se, že vylepšený APT může poskytnout klinický efekt, podobně jako přirozeně se vyskytující lidský APT, v dávce přibližně 10 % dávky, která je doporučena při použití přirozeně se vyskytujícího lidského APT, a to i s jednorázovou dávkou. Kromě toho vylepšený APT podle předkládaného vynálezu vykazuje následující cenné vlastnosti, které byly dosud neznámé pro nativní lidský APT a modifikovaný APT. a) Protizánětlivá aktivita. V místě trombu se zjišťuje nejen vznik samotného trombu, ale i tvorba produktů degradace fibrinu nebo stopového množství kininu. O těchto látkách je známo, že mají aktivitu vyvolávající zánět, a tak způsobují zánět v oblasti trombu. Z tohoto důvodu je žádoucí, aby činidlo používané k léčbě trombózy mělo nejen trombolytickou aktivitu, ale také protizánětlivou aktivitu. Jako výsledek výzkumu byl žadatel schopen udělit protizánětlivou aktivitu vylepšenému APT na základě dvou funkcí. Jedním z nich je, že vylepšený APT inhibuje biologickou aktivitu interleukinu 1 (IL-1), který je jedním z mediátorů zánětlivá reakce. Předpokládá se, že IL-1 produkovaný makrofágem se účastní zánětlivé reakce prostřednictvím hypertermie, zrychlením růstu fibroblastů, produkcí kolagenázy v synoviální buněčné membráně a tak dále nebo prostřednictvím zrychlení syntézy prostacyklinu ve vaskulárních endoteliálních buňkách. Je také známo, že IL-1 působí na jaterní buňky, urychluje produkci proteinů (sérový amyloidový protein, fibrinogen atd.) akutní fáze, která se zvyšuje se zánětem. Přihlašovatel zjistil, že zlepšený APT inhibuje aktivitu (LAF aktivitu) pro zvýšení mitogenní reaktivity myšího thymocytu, což je jedna z biologických aktivit IL-1. Další funkcí je, že pokročilý APT má afinitu k denaturovanému proteinu (denaturovaný imunoglobulin G, denaturovaný albumin atd.), který je výsledkem zánětu v místě trombu, a dále má tu vlastnost, že je tímto denaturovaným proteinem aktivován. Díky této aktivitě vylepšený APT degraduje pouze denaturovaný protein v oblasti zánětu a zánět lze dočasně zmírnit. Žadatel potvrdil gelovou elektroforézou s dodecylsulfátem sodným, že zlepšený APT degraduje pouze denaturovaný protein. Jak je znázorněno na OBR. 26, aktivace a selektivita zlepšeného APT denaturovaným proteinem je evidentní. S imunoglobulinem G ošetřeným HC1 a při několikanásobně nižších koncentracích byla prokázána stejná aktivita jako u fibrinogenu ošetřeného BrCN. Na druhé straně normální imunoglobulin C nevykazuje aktivační účinek na vylepšený APT ani při koncentraci 500 μg/ml. Prevence opětovného uzavření po obnovení perfuze do uzavřené krevní cévy. Je známo, že při léčbě trombózy přirozeným APT je po obnovení průtoku krve do zablokované krevní cévy pozorována s vysokou frekvencí reokluze. Z tohoto důvodu se kombinovaná terapie provádí s inhibitorem koagulace krevních destiček nebo antikoagulantem. Kombinovaná terapie však přináší problémy s interakcí. léky, kontrola dávkování, podobné účinky a tak dále. S výhodou má samotný APT navíc aktivitu zabraňující opětovné okluzi. Zlepšený APT podle předkládaného vynálezu má schopnost zabránit reoklusním příhodám prostřednictvím dvou typů aktivity. Prvním typem je prevence rychlého poklesu koncentrace APT po zavedení vylepšeného APT v důsledku prodlouženého trvání účinku, což vede k eliminaci Stewart-Holmesova příznaku a tím k zamezení vzniku reokluze. Druhým typem je, že prevencí IL-1-indukovaného poškození vaskulárních endoteliálních buněk je nepřímo inhibována koagulace krevních destiček, čímž se zabrání reoklusním jevům. c) Zvýšená stabilita. Proteinové přípravky jsou většinou nestabilní, proto je vhodné přípravky skladovat ve zmrazeném, suchém stavu nebo v nízké teploty ve formě roztoku. Při podávání aktivátoru plazminogenu pacientovi s akutním infarktem myokardu je potřeba provést zákrok do několika hodin po začátku záchvatu, aby se snížila úmrtnost. V tomto případě jsou žádoucí stabilní přípravky, které lze skladovat při pokojové teplotě. Kromě, zvýšená stabilita umožňuje tepelnou úpravu, úpravu kyselinou atd. při přípravě léků. Zejména s ohledem na vylepšený APT podle předkládaného vynálezu, který je produkován buněčnými kulturami, je možné odstranit retrovirus pocházející z buňky, o kterém je známo, že je citlivý na teplo. Vynález je dále popsán konkrétněji s odkazem na příklady, ale není na ně omezen. Pokud není uvedeno jinak, rekombinantní DNA se vyrábí podle laboratorních pokynů. Maniatis T a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manuál, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York (1982). Příklad 1. Klonování do APT DNA. Buňky Bowesova lidského melanomu (zakoupené od Dr. Roblina, R., National Cancer Research Institute, USA) byly kultivovány podle metody Opdenakker et al. (Opdenakker, G., a kol., Eur. J. Biochem, 131, 481-487 (1983)). Pro indukci APT mRNA byl ke kultivační směsi přidán TPA (12-0-tetradekanoylforbol-13-acetát) v konečné koncentraci 100 ng/ml, následovala kultivace po dobu 16 hodin. Celková buněčná RNA byla poté extrahována z kultivovaných buněk podle modifikované metody Freemana et al. ((Okayama)Berqa DNA Manual, str. 3, 1985, Pharmacy Fine Chemicals). Pomocí kolony s oligo-dT celulózou (vyrobené Pharmacia Fine Chemicals) se poly(A) + RNA oddělí od celkové buněčné RNA. Výsledkem je, že z přibližně 10 o buněk se získá asi 400 μg poly(A) + RNA. Tato poly(A) + RNA se frakcionuje konvenčním způsobem centrifugací v gradientu hustoty sacharózy. Vybere se část frakcionované poly(A) + RNA a provede se dot blot hybridizace (Perbal, B., Apractical Gube to Molecular Cloninq, 410, 1984, John Wiley and Sons, Inc) s použitím oligonukleotidové sondy specifické pro APT mRNA. . Zde použitá sonda (sonda Y) má sekvenci bází 5"-GCNNGGCAAAGATGGCA-3", která je komplementární k oblasti mRNA kódující aminokyselinové zbytky +291 až +297 v sekvenci APT popsané Pennicaetalem a je syntetizována -kyanofosfamidátová metoda s použitím syntetizátoru DNA, model 380A, (vyrábí Applied Biosystems). Syntéza DNA oligomeru, deprotekce, štěpení pryskyřice a purifikace se provádějí v souladu s návodem k použití syntetizéru DNA, Model 380A. Radioaktivní značení Y sondy na 5" konci se provádí v souladu s laboratorním manuálem za použití T4 polynukleotidkinázy (vyrábí Taka-Ra Shuzo Co., Ltd.) a -(32P) ATP. Sonda Y silně hybridizuje, hlavně s 20-30S poly(A) + RNA (tato frakce se nazývá M frakce). Pomocí templátu se z frakce M získá 10 μg poly(A) + RNA; 3 μg dvouřetězcové cDNA byly syntetizovány pomocí reverzní transkriptázy (vyrábí Biochemical Industry Co., Ltd.) podle Gubler-Hoffmanovy metody (Gubler, U. a Hoffman, B.J., Gene 25, 263, 1983) a přidány k dvouvláknové cDNA na 3"-koncovém deoxy C-vláknu podle Denq-Wu metody (Denq, G. R. a Wu, R., Nucleic Acids Res., 9, 4173, 1981). deoxy C řetězcem se pak podrobí gelové filtraci na Sepharose CL 4B (vyrábí Fine Chemicals Pharmacy), aby se odstranily nukleové kyseliny s nízkou molekulovou hmotností, které mají méně než 500 párů bází. cDNA se poté žíhá s pBR322 (vyrábí Bethesda Research) obsahující deoxy G-vlákno v místě Pst 1 za použití tradičních technik Směs získaná po nasedání se transformuje do kompetentních buněk HB101 E. coli (vyrobeno společností Takara Shuzo Co., Ltd.), což vede k bance cDNA sestávající z přibližně 4000 nezávislých Tato cDNA se podrobí hybridizaci kolonií za použití sondy Y popsané výše v souladu s Woodsovou metodou (Woods, D., Focus, 6 (3), 1, 1984, vyrobeno Bethesda Research Lab.), čímž se získají klony, které interagují se sondou Y. Mezi klony je identifikován klon pTPA1 obsahující nejdelší cDNA APT. Potom se provede dideoxy metoda (Carlson, J., a kol., J. Biotechnoloqy, 1, 253, 1984), za použití fágového vektoru M13 a metody 7-DEAZA (Mizusawa S., a kol., Nucleis Acids Res., 14, 1319, 1986). V důsledku toho bylo zjištěno, že plazmid pTPA1 obsahuje sekvenci bází od Ty+441 do Ay+2544 pro gen APT popsaný Pennicaetalem. Příklad 2. Návrh vylepšeného APT (II). V plazmidu pTPA1 ukázaném v příkladu 1 je N-terminální oblast nedostatečná pro konstrukci vylepšeného APT (II), který postrádá doménu smyčky 1. Deficitní segment DNA se tedy syntetizuje, jak je popsáno výše, za použití syntetizátoru DNA 380A (vyrobeného společností Applied Biosystems). Sekvence bází syntetizovaného oligomeru a kompletní syntetizovaná sekvence jsou uvedeny na OBR. 1-4. Specifické techniky pro konstrukci zlepšeného APT (II) s použitím těchto oligomerů jsou ukázány na OBR. 5-6. 2-1). Konstrukce bloku IV (fragment Bql II-Eco R1, asi 480 párů bází). Fragment bloku IV na Obr. 5 se získá následovně. Nejprve, podle laboratorní příručky, 40 pmol každého ze syntetických oligonukleotidů 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 a 15 znázorněných na Obr. 1-2 byly fosforylovány 10 jednotkami T4 polynukleotidkinázy (vyráběné společností Takara Shuzo Co., Ltd.) při 37 °C po dobu jedné hodiny v 50 ul reakčního roztoku pro každou z nich. Na reakční roztok se působí fenolem. Po vysrážení ethanolem se sraženina suší za sníženého tlaku a rozpustí se ve sterilní destilované vodě. Po usazení 40 pmol každého oligomeru ve 150 μl roztoku obsahujícího 6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM NaCl, 7 mM MgCl2 a 0,1 mM EDTA při teplotě 80 °C po dobu 5 minut při teplotě 60 o C po dobu 5 minut a při pokojové teplotě po dobu jedné hodiny, v odpovídajících blocích bloku I (oligomery 1, 2, 3 a 4), bloku II (oligomery 5, 6, 7, 8, 9 a 10) a bloku III (oligomery 11, 12, 13, 14, 15 a 16) provádějí srážení ethanolem a sušení za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí ve 40 ul sterilní destilované vody. Reakce byla prováděna ve 400 ul reakčního roztoku při 4 °C po dobu 15 hodin za použití DNA ligační soupravy (vyrobené firmou Takara Shuzo Co., Ltd.). Po vysrážení ethanolem a vysušení za sníženého tlaku se sraženina rozpustí sterilní destilovanou vodou: v případě bloku I (1) se gelová elektroforéza provádí v 5% polyakrylamidu (laboratorní příručka), separuje se a čistí se tradičním způsobem (laboratorní příručka), fragment asi 100 párů bází a v případě bloku II (2) a bloku III (3) se gelová elektroforéza provádí v 3% agarózovém gelu (LMP agaróza, výrobce BRL) (laboratorní příručka ) a fragmenty asi 190 párů jsou izolovány a purifikovány elektroelucí (laboratorní příručka). Poté bylo 0,1 ug, 0,2 ug a 0,2 ug fragmentů bloku I, bloku II a bloku III ligováno pomocí výše uvedené DNA ligační soupravy. Gelová elektroforéza se provádí při koncentraci agarózy 1,5 %, aby se izoloval fragment Bgl II-Eco Rl (blok IV) o velikosti přibližně 480 párů bází. DNA je poté izolována z agarózového gelu pomocí elektroeluce. Tato DNA se potom fosforyluje ve 100 ul reakčního roztoku při 37 °C po dobu jedné hodiny za použití 10 jednotek výše uvedené T4 polynukleotidkinázy, potom se zpracuje s fenolem, vysráží se ethanolem a suší se za sníženého tlaku. Tento syntetický genový fragment a sekvence bází bloku IV jsou potvrzeny stanovením sekvence bází dideoxy metodou za použití fágového vektoru M13. Specifické techniky jsou znázorněny na Obr. 6. Po ligaci výše popsaného fragmentu Bgl II-Eco Rl bloku IV s M13 mp18 DNA (vyrobeno společností Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) štěpenou restrikčními enzymy BamH1 (vyrobeno společností Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd. .) a Eco R1 (výrobce Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) určují jeho základní sekvenci pomocí sekvenační sady M13 (vyrábí Taraka Shuzo K., Ltd.) a sekvenační sady 7-DEAZA (vyrábí Takara Shuzo Co., Ltd.). Místo štěpení restrikčního enzymu Bgl1 a místo štěpení restrikčního enzymu BamH1 jsou ligovány v isoschimérickém uspořádání prostřednictvím (místo štěpení konce BamH1-Bgl11) a ligovaný fragment může být štěpen restrikčním enzymem Xho 11, což vede k přirozenému Bgl 11, respektive Bamh1 štěpné konce. Pro přesnější určení sekvence bází je kmen E.cjli JM109 infikován fágem M 13mp18 (včetně fragmentu bloku IV) v souladu s metodou Messing/Messing J., Methods in Enzymology, 101, 20-78 (1983). )), načež se získá dvouvláknová DNA (replikativní typ). Po štěpení této DNA (50 μg) restrikčními enzymy Xho 11 (výrobce Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co) a Eco R1 byla provedena gelová elektroforéza na 1,5% agarózovém gelu, aby se izoloval fragment (blok IV) o velikosti asi 480 bází. páry. Tato DNA je extrahována elektroelucí. Po ligaci extrahované DNA s M13mp19 DNA (vyrobeno společností Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd) štěpenou restrikčními enzymy Eco Rl a BamHl stejným způsobem, jak je popsáno výše, byla určena sekvence bází pomocí DNA ligační soupravy. Jak je popsáno výše, tuto sekvenci lze přesněji ověřit sekvenováním obou DNA pomocí M13mP18 a M13mp19. Kromě toho byla popsaným způsobem připravena dvouřetězcová replikativní DNA M13mp19 (s blokem IV). Po štěpení této DNA (50 ug) restrikčními enzymy Eco R1 a Xho 11 se provede gelová elektroforéza v 1,5% agarose, přičemž se izoluje fragment (blok IV) o velikosti asi 480 párů bází. 2-2). Izolace bloku V (fragment Eco R1-Bal1, asi 1250 párů bází). Z klonu pTRA1 získaného v příkladu 1 se izolovala plazmidová DNA ve velkých množstvích podle metody popsané v laboratorní příručce, jak je ukázáno na OBR. 5. Po štěpení 70 μg této DNA restrikčními enzymy Bal1 (výrobce Takara Shuzo Co. , Ltd.) a Nar1 (vyrábí Nirro Gene Co., Ltd.) provádějí elektroforézu v 0,8% agarózovém gelu, přičemž se izoluje fragment Nar1-Bal1 (asi 1540 párů bází). DNA se izoluje elektroelucí. Po dalším částečném štěpení této DNA restrikčním enzymem EcoRl se provede elektroforéza na 0,7% agarózovém gelu, přičemž se izoluje fragment EcoRl-Bal1 (asi 1250 párů bází). DNA se izoluje elektroelucí. 2-3). Konstrukce vylepšeného genu APT (II) z bloku IV a bloku V. Jak je znázorněno na OBR. 5, zlepšený gen APT se získá následovně. Po dopingu bloku IV (fragment Bgl11-Eco R1, asi 480 bp) získaného v příkladu 2-1 blokem V (fragment Eco R1-Bal1, asi 1250 bp) získaným v příkladu 2-2 za použití soupravy pro doping DNA popsané výše, dopovaný produkt se podrobí srážení ethanolem. Po vysušení za sníženého tlaku se sraženina obvyklým způsobem štěpí restrikčním enzymem Xho 11. Poté se provede elektroforéza v 0,8% agarózovém gelu, aby se izoloval fragment Bgl 11-Xho 11 (asi 1500 párů bází, obsahuje gen pro zlepšený APT). DNA je poté izolována elektroelucí. Kompletní sekvence bází vylepšeného genu APT (II) získaná tímto způsobem je znázorněna na Obr. 8-13. Odvozená aminokyselinová sekvence je také ukázána na OBR. 14-19. Příklad 3. Konstrukce genu pro zlepšené APT V, VI a VIII. Konstrukce vylepšeného genu APT V, VI nebo VIII se provádí na základě vylepšeného genu APT (II) s odkazem na následující publikace. Genetická konverze se provádí indukcí místně specifické mutace. Publikace: Zoller M. J. a Smith. M., Method in Fermentology, 100, str. 468-500 (1983), Zoller M. J. a Smith. M. DNA, 3, str. 479-488 (1984), Morinaga Y. a kol. Biotechnology, str. 636-630 (červenec 1984), Adelman J. P. a kol., DNA, 2, str. 183-193 (1983 ), 6. M13 Sequencing Manual (puC) publikovaný Gene Science Room Co., Ltd.). 3-1). Konstrukce vylepšeného genu APT (V). A) Vytvoření M13mp19 (APT/P/) pro mutaci. Vylepšený fragment genu APT (II), podrobně popsaný v příkladu 2, 2-3, byl ligován do dvouřetězcové DNA M13mp9 ošetřené restrikčním enzymem BamH1 a alkalickou fosfatázou (vyrábí Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligační produkt byl transfekován do kompetentních buněk E. cjli JM109 (vyrobeno společností Takara Shuzo Co. , Ltd). Každý klon, který vytvoří bezbarvou, sterilní skvrnu, se použije k infekci E. coli JM109. Jednovláknová DNA se izoluje ze supernatantu kultury a dvouvláknová (replikativní) DNA se izoluje z buněk E. cli podle Messingovy metody (J. Messing, Methods in Enzymology, 101, str. 20-78, 1983). ). Analýzou povahy těchto dvouvláknových DNA se po štěpení restrikčním enzymem Pst1 elektroforézou na agarózovém gelu získá klon mp9 (vylepšený APT(II)), ve kterém je gen APT(II) vložen do mp9 DNA v požadovaný směr, jak je znázorněno na obr. 21. Po štěpení části těchto DNA restrikčním enzymem Pst se provádí elektroforézou na 0,8% agarózovém gelu, kde klon mp9 (vylepšený APT (II) vykazuje jednoduchý pás v pozicích 7300 bp, 840 bp, 430 bp a 80 bp, přibližně Jednovláknová DNA tohoto klonu se použije v následujícím experimentu k vyvolání místně specifické mutace.B) Syntéza primeru schopného vyvolat místně specifickou mutaci. Syntetický oligonukleotid použitý k indukci místně specifické mutace ve vylepšeném genu APT (II) se syntetizuje metodou -kyanoethylfosfoamidátu s použitím syntetizátoru DNA, model 380 A (vyrobeno společností Applied Biosystems). Syntéza oligomeru DNA, odstranění ochranné skupiny, odštěpení z pryskyřice a čištění se provádějí v souladu s provozními pokyny pro syntetizér DNA 380 A. Pro vyvolání mutace na konkrétním místě se použije primer (1) schopný indukující místně specifickou mutaci a primer (2) pro dideoxy sekvenování za použití fágového vektoru M13 (J. Carlson a kol., Journal of Biotechnology, 1, str. 253, 1984). Jsou uvedeny aminokyselinové a nukleotidové sekvence pro vylepšený APT (II). Primer (1), schopný vyvolat mutaci, se liší podtrženou bází od genové sekvence vylepšeného APT (II) (viz tabulka 1). C) Indukce místně specifické mutace. Níže je uveden způsob vytvoření klonu obsahujícího sekvenci bází primeru (1) schopného produkovat mutaci, konkrétně vylepšený gen APT (IV). Po nasednutí (renaturaci) jednovláknové DNA popsané v příkladu 3.3-1, A) klonu mp9 (vylepšený APT (II) a primer (1), je produkt renaturace převeden na dvouvláknovou DNA, která je následně transformována na E. coli JM 109. Potom se pomocí sekvenačního primeru prohledají sekvence DNA, přičemž se izoluje fágový klon nesoucí mutovaný vylepšený gen APT (II), konkrétně vylepšený gen APT (V). Z tohoto klonu se extrahuje dvouvláknová (replikativní) fágová DNA a izoluje se vylepšený gen APT (V). 5"-Terminální fosforylace syntetického oligomeru. DNA primer (1) k vyvolání místně specifické mutace se fosforyluje metodou popsanou v příkladu 2.2-1. Příprava heteroduplexu DHE. 0,5 μg jednovláknové DNA M13mp9 (vylepšené APT (II)) a 1,5 μg dvouvláknové DNA M13mp9, štěpené restrikčním enzymem BamH1, se zahřívá v 30 μg roztoku obsahujícím 2 pmol fosforylovaného primeru (1) 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA a 50 mM NaCl, při teplotě 90 o C (2 min), 50 o C (5 min), 37 o C (5 min) a při pokojové teplotě (10 min).36 μl roztoku 50 mM K roztoku se přidá Tris-HCl (pH 8,0) obsahující 4 jednotky Klenowova enzymu, 7 jednotek T4 fágové DNA ligázy, 0,1 mM EDTA, 12 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol, 0,7 mM ATP, 0,07 dATP a mM každého z dGTP, dTTP a dCTP, aby se stimulovalo prodloužení primeru. Směs se nechá reagovat při 20 °C po dobu 2 hodin a při 4 °C po dobu 15 hodin. Transformace se provede za použití výše popsaného roztoku a kompetentních E. coli buňky JM109 (vyrobené společností Takara Shuzo Co., Ltd.), dokud se nevytvoří lyzační skvrny. Po oddělení bezbarvé skvrny je fág infikován E. coli JN109 pro proliferaci. Templátová jednovláknová DNA se pak získá ze supernatantu kultury pro každý klon. Tyto jednořetězcové DNA jsou podrobeny pouze „T" reakci (reakce „A" a „T" v příkladu 3-2) dideoxy metody za použití sekvenačního primeru (2), následované elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Po vysušení se gel analyzuje autoradiografií. Na základě výsledků je identifikován klon mající požadovanou mutantní sekvenci. Kultivační supernatant klonu se použije k infekci buněk E. coli JM109 a znovu se naočkuje na plotnu, aby se izolovala jediná skvrna. Z výsledné jediné skvrny se výše uvedeným způsobem izoluje jednovláknová DNA. Pomocí těchto DNA se nejprve určí sekvence bází DNA dideoxy metodou za použití sekvenačního primeru (2), čímž se získá klon mutovaný na požadovanou sekvenci bází. Po infekci tohoto fágového klonu buňkami JM-109 E. coli za použití Messingovy metody popsané v příkladu 2 se získá dvouvláknová DNA. Tato dvouvláknová DNA se štěpí restrikčním enzymem Xho 11, provede se elektroforéza v 0,8% agarózovém gelu, aby se izoloval fragment (vylepšený gen APT (V) o velikosti asi 1500 párů bází, obsahující vylepšený gen APT. DNA je poté extrahována elektroelucí. Kromě toho je úplná sekvence bází takto získané DNA stanovena dideoxy metodou, přičemž se zjistí, že DNA je vylepšený APT (V) gen. Kompletní sekvence bází takto získaného vylepšeného genu APT (V) (ale obsahující signální peptid -35 až -1) je ukázána na OBR. 11 - 13. Odvozená aminokyselinová sekvence je také ukázána na OBR. 17 - 19. 3-2) Návrh vylepšeného APT (VI) a (VIII). Techniky jsou podobné těm popsaným v příkladu 3, 3-1). Nejprve se zkonstruuje M13mp3 (vylepšený APT (II)) a poté se syntetizují primery pro indukci místně specifické mutace. Sekvence bází těchto primerů je však popsána výše, aby se zkonstruoval vylepšený gen APT (VI) a vylepšený gen APT (VIII), fosforylovaný primer s 5" koncem (3) a fosforylovaný primer s 5" koncem (5 ) (viz tabulka .2). Po indukci místně specifické mutace je kompletní sekvence bází určena dideoxy metodou. Bylo potvrzeno, že mají požadované sekvence bází. Tak jsou získány geny pro zlepšený APT (VI) a zlepšený APT (VIII). Tyto geny jsou poté integrovány do vektoru pVY1 v souladu s postupem popsaným v příkladech 4 a 5. Příklad 4. Integrace vylepšeného genu APT (II) do vektoru pVY1. 4-1) Konstrukce vektoru pVY1. Vektor pVY1 se připraví tak, jak je ukázáno na OBR. 7. A) Konstrukce pAdD26SV (A) N3 (N) a tupé zakončení místa štěpení Eco R1. Nejprve se DNA pAdD26SV(A) N3 (zakoupená od Dr. Hiroshi Handa na Tokijské univerzitě, známá z abstraktů v Mo1, Ce 11. Biol, 2 (11, (1982)) štěpí restrikčním enzymem Bgl11 (vyrobeno od Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) tradičním způsobem DNA se pak otupí tradičním způsobem pomocí Klenowova enzymu (vyrábí Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) Po ošetření fenolem, vysrážení pomocí ethanolu a sušení za sníženého tlaku, sraženiny se rozpustí ve sterilní destilované vodě.Po další ligaci se reakční směsí transformují kompetentní buňky HB101 E. coli (vyrobené firmou Takra Shuzo Co. Ltd.) Plazmidové DNA se připraví z transformantů vykazujících rezistence na tetracyklin obvyklým způsobem.Po odštěpení části těchto DNA restrikčním enzymem BgL 1 se provede elektroforéza na 0,7% agaróze. Výsledkem je klon nesoucí DNA, která není štěpena restrikčním enzymem BgL 11. Po štěpení (pAdD26SV(A) N3 (N)) DNA tohoto klonu restrikčním enzymem Eco R1 tradičním způsobem je DNA ztupeny pomocí Klenowova enzymu, jak je popsáno výše. Po ošetření fenolem, vysrážení ethanolem a vysušení za sníženého tlaku se sraženina rozpustí v destilované sterilní vodě. B) Izolace fragmentu Kpn 1-BamHl (asi 2900 bp) z pKSV10 a vytvoření tupých konců. Poté, co je pKSV10 DNA (vyrobeno Fine Chemicals) štěpena restrikčními enzymy Kpn1 a BamH1 tradičním způsobem, jsou DNA tupé konce pomocí T4 DNA polymerázy (laboratorní příručka, str. 114 - 121). Poté se provede elektroforéza v 0,7% agarózovém gelu, aby se izoloval fragment o velikosti asi 2900 párů bází. Fragment je poté elektroeluován pro extrakci DNA

C) Konstrukce pVY1. Po ligaci DNA fragmentu získaného v A) a DNA fragmentu získaného v B) se provede transformace kompetentních buněk E. coli HB101 (popsáno výše). Plazmidová DNA se získá z transformantů vykazujících rezistenci k tetracyklinu za použití tradiční metody. Poté, co byla část těchto plasmidových DNA štěpena restrikčním enzymem Pst1 (vyráběný Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd), byla provedena elektroforéza na 1,0% agarózovém gelu. Výsledkem je klon (plazmid pVY1) charakterizovaný pásy o délce přibližně 3400 párů bazí, přibližně 3200 párů bazí a přibližně 1400 párů bazí. Tento klon E/coli HB101 (pVY1 byl uložen ve Fermentačním výzkumném ústavu Agentury pro průmyslovou vědu a technologii Japonska pod registračním číslem P-9625 (FEPM BP 2106). 4-2) Integrace vylepšeného genu APT (II ) do vektoru pVY1. Po štěpení DNA plazmidu pVY1 získaného v příkladu 4-1) restrikčním enzymem BgL 11 tradičním způsobem se defosforylace provádí pomocí alkalická fosfatáza (výrobce Takara Shuzo. Co. Ltd.). Poté se třikrát provede ošetření fenolem. A po vysrážení ethanolem a vysušení za sníženého tlaku se sraženiny rozpustí ve sterilní destilované vodě. Po ligaci této DNA s BgL fragmentem 11-Xho 11 (asi 1500 párů bází) získaným v příkladech 3, 3-1) a HB101 kompetentní buňky E. coli byly transformovány ligačním produktem v souladu s metodou popsanou výše. Plazmidová DNA se připravuje z transformantů rezistentních na tetracyklin tradičním způsobem. Po štěpení těchto DNA restrikčními enzymy (BqL 11, Pst 1) se vybere klon se zlepšeným genem APT (II) ve vektoru pVY1 integrovaným v požadovaném směru a selekce se provede na základě analýzy vzor elektroforézy na agarózovém gelu. Nejprve se část těchto DNA štěpí restrikčním enzymem BqL 11, následuje elektroforéza na 0,8% agarózovém gelu, čímž se získá klon s pásem fragmentu o velikosti přibližně 1500 bp, když se fragment BqL 11-Xho 11 liguje do BqL. fragment 11 plasmidů pVY1, ligovaná část Xho 11 a BqL 11 může být odříznuta restrikčním enzymem BqL 11. Část plasmidové DNA těchto klonů je dále štěpena restrikčním enzymem Pst1 a DNA je podrobena elektroforéze v 0,8% agarózovém gelu pro získání klonu majícího jeden pás o velikosti přibližně 3400 bp, dva pruhy přibližně 2300 bp, jeden pruh přibližně 1400 bp a jeden pruh přibližně 80 bp. Pomocí tohoto klonu (plazmid pVY1-APT (II) podle laboratorní příručky se získá plazmidová DNA. Příklad 5. Integrace genů vylepšeného APT (V), (VI) a (VIII) do vektoru pVY1. Po štěpení DNA plazmidu pVY1 získaného v příkladu 4-1) se defosforylace restrikčního enzymu BqL 11 provedla konvenčním způsobem za použití alkalické fosfatázy (vyrábí Takara Shuzo Co., Ltd.) a poté se ošetřila (třikrát) fenolem, vysrážením ethanolem a sušením za sníženého tlaku. Sediment se poté rozpustí ve sterilní destilované vodě. Po ligaci této DNA s fragmentem BqLII-Xho 11 o velikosti přibližně 1500 párů bází získaným v příkladech 2, 2-3) se ligační produkt transformuje do výše kompetentních buněk HB101 E. coli. Plazmidové DNA se připraví z transformantů vykazujících rezistenci k tetracyklinu podle běžné metody. Po štěpení těchto DNA restrikčními enzymy BqL11 a Pstl se provede elektroforéza na agarózovém gelu. Analýzou separačního vzoru v agarózovém gelu se vyberou klony, ve kterých je vylepšený gen APT (V) vložen do vektoru pVYI v požadovaném směru. Nejprve se po štěpení některých z těchto DNA restrikčním enzymem BqL11 provede elektroforéza na 0,8% agarózovém gelu, aby se získaly klony a získal se pás o přibližně 1500 párech bází. Když je fragment BqL11-Xholl spojen s fragmentem BqL11 vektoru pVYI, část Xholl a BqL11 může být odštěpena restrikčním enzymem BqL11 díky výše uvedené konfiguraci izoschizomeru. Po dalším štěpení části plazmové DNA těchto klonů restrikčním enzymem Pstl se provede elektroforéza při koncentraci agarózového gelu 0,8 % a získá se klon poskytující pás přibližně 3400 bp, pás přibližně 2300 bp, dvě pásma asi 1400 bp, jedno pásmo asi 800 bp a jedno pásmo asi 80 bp. Pomocí klonu (plazmid pVYI-APT (V)) se získá plazmidová DNA ve velkém množství na základě laboratorní příručky. Podobně jsou geny pro zlepšené APT (VI) a (VIII) integrovány do vektoru pVYI. Příklad 6 Exprese pokročilého APT v buňkách CHO. Plazmid pVYI - vylepšený APT (VI), APT (II), APT (V) nebo APT (VIII) je transfekován do DHFR-deficientních CHO buněk (Urlaub, et al., Proč. Nati., Acad. Sci. USA, 77 (7), 4216-4224, 1980) metodou fosforečnanu vápenatého (Graham a kol., Viroloqy, 52, 456, 1973). Bylo zjištěno, že klon transformantů získaný na selektivním médiu (MEM A LPHA (-), GIBCO) v přítomnosti methotrexátu (MTX) vykazuje aktivitu APT 50 až 100 jednotek/ml (hodnota stanovená popsanou metodou fibrin/agaróza níže). Tento klon se použije pro následné studie. Použitým produkčním médiem je médium GIT (vyrábí Huaco Pure Chemical Industry Co., Ltd.) doplněné 20 mezinárodními jednotkami/ml (SIGMA) aprotininu. Příklad 7. Purifikace zlepšeného APT ze supernatantu kultury CHO buněk. Kultivační supernatant získaný v příkladu 6 byl částečně purifikován pomocí afinitní kolony anti-APT monoklonální protilátky. Pro APT pocházející z lidských melanomových buněk se tradičním způsobem připraví hybrid produkující monoklonální protilátky. Hybrid produkující protilátku je naočkován myším a monoklonální protilátka (podtřída: IgGM1) vyvinutá v ascitu je extrahována a purifikována pomocí Cellulophin Protein A (vyrábí Biochemical Industry Co. , Ltd) a pufrovací systém MAPS pro čištění monoklonálních protilátek vyrobený společností Biorad Laboratories. Protilátka je navázána na CN3r-aktivovanou Sepharosu (vyrábí Pharmacia Fine Chemicals) rychlostí 4 mg na 1 ml gelu tradičním způsobem. Gel protilátky (24 ml) se smíchá se čtyřmi litry supernatantu kultury. Po mírném protřepávání přes noc při 4 °C se gel vloží do kolony (průměr 1,5 cm x 20 cm). Gel se poté postupně promyje 125 ml každého z následujících roztoků (1) Tris-HCl pufr pH 7,4 (pufr A) obsahující 25 mezinárodních jednotek/ml aprotininu (vyrábí SIGMA) a 0,01 % (w/v) Tween 80 (2) pufr A obsahující 0,5 M NaCl, (3) pufr A obsahující 4 M močovinu a (4) pufr A. Pokročilý gel vázaný APT byl eluován pufrem 0,2 M glycin-HCl pH 2. 5 obsahujícím 25 mezinárodních jednotek/ml aprotininu a 0,01 % (w/v) Tween 80. Aktivní frakce se zredukují a spojí. Po dialýze proti 10 mM Tris-HCl pufru, pH 7,4, obsahujícímu 25 mezinárodních jednotek/ml aprotininu a 0,01 % (w/v) Tween 80 přes noc, se dialyzát koncentruje 20-30krát pomocí vakuového odstředivého koncentrátu (Speed ​​VAC, vyrobeno od SAVANT Inc.). Koncentrát se znovu dialyzoval proti 10 mM Tris-HCl pufru, pH 7,4, obsahujícímu 0,15 M NaCl, 25 mezinárodních jednotek/ml aprotininu a 0,01 % (hmotn./obj.) Tween 80, přes noc a použil se pro následná hodnocení in vitro a in vivo. . Nakonec se specifická aktivita zvýší 3700-5000krát a výtěžek je od 36 do 42 % aktivity APT (stanoveno metodou fibrin/agaróza). Tato aktivní frakce se analyzuje elektroforézou s dodecylsulfátem sodným a barvením stříbrem. Za redukčních podmínek je pozorován velmi silný pás při 54 kilodaltonech spolu s několika dalšími pásy. Na elektroforetický gel se potom působí 2,5% (hmotn./obj.) Triton X-100 a umístí se na fibrin/agarózovou desku k autogramu fibrinu při 37 °C, přičemž rozpuštěný pás je detekován při asi 50 kilodaltonech. Na stejné desce se přirozený APT objevuje asi 60 kilodaltonů. Výsledky ukazují, že APT adsorbovaný na protilátkové afinitní koloně a eluovaný tímto způsobem odpovídá zlepšenému APT s molekulovou hmotností, která je přibližně o 10 000 nižší než molekulová hmotnost přirozeně se vyskytujícího typu. Příklad 8. Měření specifické aktivity vylepšeného APT. Množství proteinu v částečně purifikovaném pokročilém APT se stanoví měřením celkového proteinu podle BradFordovy metody (Bradford, Anal. Bochem., 72, 248 (1976)), s použitím hovězího sérového albuminu jako referenčního proteinu. Měří se množství antigenu APT enzymový imunotest(ELISA). Fibrinolytická aktivita byla stanovena metodou fibrin/agaróza a metodou rozpouštění 125 1-značeného fibrinového filmu. Fibrin/agaróza se připraví přidáním agaru k 95% koagulovanému fibrinogenu. Způsob rozpouštění 1-značeného fibrinového filmu 125 se provádí tak, jak je popsáno v Hoyraeerts et al. (J. Biol. Chem. 257, 2912, 1982), s použitím jako standardu APT z lidských melanomových buněk vyrobených Bioscott Inc. a standardizované v souladu s mezinárodním standardem APT (Gaffuey a Curtis, Thromb. Haemostas, 53, 34, 1985). Hodnota specifické aktivity, vypočtená z hodnoty aktivity stanovené metodou rozpouštění 125 1-fibrinového filmu a množství antigenu stanoveného enzymatickou imunoanalýzou (ELISA), se pohybovala od 300 000 do 420 000 jednotek/mg antigenu. Příklad 9. Afinita zlepšeného APT k fibrinu a aktivace fibrinem

V souladu s prací Verheijena a kol./EMBOJ, 5, 3525, 1986) byla studována afinita zlepšeného APT k fibrinu. Zlepšený nebo přirozeně se vyskytující APT (1000 jednotek/ml) se přidá k fibrinogenu v různých koncentracích, poté se přidá jedna jednotka trombonu a následuje reakce při teplotě místnosti po dobu 3 minut. Výsledná fibrinová sraženina se vysráží centrifugací při 16 000 otáčkách za minutu po dobu 8 minut a množství APT, které není navázáno na fibrin, se stanoví měřením aktivity metodou fibrin/agaróza. V důsledku toho bylo zjištěno, že zlepšený APT (VI) vykazuje stejnou afinitu k fibrinu jako přírodní forma. Aby se prozkoumal stupeň aktivace plazminogenu zlepšeným APT v přítomnosti nebo nepřítomnosti fibrinu, byl proveden následující experiment. Pomocí titrační destičky se přirozeně se vyskytující nebo zesílený APT přidá k 0,1 M Tris-HCl pufru, pH 7,5, obsahujícímu 0,3 mM syntetický substrát p-niroanilid tripeptid S-2251 (H-D-Val-leulys-pNA HCl, vyrobený Kabi Inc. ), 0,13 μM plasminogenu bez plasminu, 120 μg/ml DESAFIB TM (vyrábí American Diagnostics Inc.) a 0,1 % Tween 80, aby se získal celkový objem 200 μl. Systém se udržuje při 37 °C. Po určité době se měří absorbance (optická hustota) při vlnové délce 405 nm pomocí Titertech Multiscan 310 Model. Křivka dávka-odpověď pro amidolytickou aktivitu zlepšeného APT (VI) a přirozeně se vyskytujícího APT je ukázána na OBR. 22. Posun křivky dávka-odpověď v důsledku přidání DESAFIB TM pro přirozeně se vyskytující APT odpovídá hodnotě 158krát, zatímco u vylepšeného APT dosahuje 100krát. To je způsobeno skutečností, že aktivita vylepšeného APT (VI) v nepřítomnosti léku DESAFIB TM je nižší, přibližně 1/20, než aktivita přirozeného APT. Příklad 10. Analýza zlepšeného APT na fibrinolytickou aktivitu v krevním řečišti králíka. Farmakinetika porovnáním aktivity přirozeně se vyskytujícího APT (n-APT) a zlepšeného APT podle předkládaného vynálezu u králíka. Jak je patrné z Obr. 23, vylepšený APT vykazuje znatelné prodloužení biologického poločasu existence v aktivním stavu (přirozený APT vykazuje poločas 1-2 minuty, zatímco vylepšený APT je biologicky aktivní 8-15 minut). Navíc je evidentní, že hodnota aktivity 5 % (hodnota 30 s po podání je 100 %) stále zůstává ve vylepšeném APT i 60 minut po jeho podání (přirozený APT vykazuje aktivitu rovnou 0,1 po 60 minutách) , % původního). Tento experiment se provádí následovně

K testování je vybrán japonský bílý králík o hmotnosti 2,4 kg. V pentobarbitalové anestezii se APT podává periferní ušní žílou. Dávka je 15 400 jednotek (0,8 ml) zlepšeného APT na králíka a 5 400 jednotek (0,8 ml) n-APT na králíka (hodnoty stanovené metodou fibrinové plotny). Poté se odebere 2,5 ml krve stehenní tepna za použití katetru v různých časových intervalech (od 0,5 do 60 minut) a přidán do 1/9 objemu citrátu sodného (3,8 %). Do 30 minut po odběru krve se provádí centrifugace při nízké rychlosti, čímž se oddělí plazma. Pomocí separované plazmy se měří aktivita APT v krvi. (1) Měření aktivity APT. Po 16násobném zředění 0,2 ml plazmy 3 mM ledovou kyselinou octovou se zředěný produkt odstředí při nízké rychlosti rotace, aby se získaly sraženiny. Precipitáty se rozpustí ve 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, se 140 mM NaCl v objemu ekvivalentním objemu plazmy, aby se získala euglobulinová frakce. Aktivita APT se stanoví přidáním této euglobulinové frakce do misky s fibrinem/agarózou. Po inkubaci destičky při 37 °C po dobu 16 hodin je aktivita APT pozorována jako plak. Standardní křivka pro metodu fibrin/agaróza se připraví zředěním APT použitého k podání zvířeti na 0,1 až 10 000 jednotek/ml. Aktivita APT v krvi stanovená tímto způsobem je vyjádřena v procentech s použitím aktivity APT získané odběrem krve 30 s po podání, brané jako 100 %. Příklad 11. Stabilita zlepšeného APT (VI) vůči teplu a kyselinám. Pro stanovení tepelné odolnosti byly zlepšené APT (VI) a přírodní APT zředěny 50 mM Tris pufrem obsahujícím 100 mM NaCl a 0,01 % Tween 80, pH 7,4, na koncentraci 100 ug/ml, v daném pořadí. Každý roztok se ponechá ve vroucí vodě (teplota 98 ​​o C) po dobu 2-60 minut. Po ochlazení se zbytková aktivita stanoví metodou fibrinové destičky. Jak je znázorněno na OBR. 24, pokles aktivity zlepšeného APT (VI) je nevýznamný ve srovnání s poklesem aktivity přirozeného APT. Například po tepelném zpracování po dobu 2 minut se aktivita přirozeného APT sníží na 25 %, zatímco vylepšený APT (VI) si stále udržuje aktivitu na 71 %. Ke studiu odolnosti vůči kyselinám se vylepšený APT (VI) a přírodní APT rozpustí v 0,5N. roztokem HCl o koncentraci 100 μg/ml a následným usazením při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Po neutralizaci se aktivita stanoví metodou fibrinové destičky. Zlepšený APT nevykazuje žádnou změnu aktivity, zatímco aktivita přirozeného APT je snížena o 50 %. Příklad 12 Inhibice aktivního faktoru stimulujícího lymfocyty zlepšeným APT (VI)

Zlepšené APT (VI) a přirozené APT byly vhodně naředěny v médiu pro tkáňové kultury PPM1 1640 obsahujícím 7 % fetálního telecího séra a 58 uM 2-merkaptoethanolu. 100 ul ředění se nanese do 96-jamkové destičky pro tkáňové kultury, poté se 50 ul buněčné suspenze obsahující thymocyty (210 7 buněk/ml) ze samců myší C3H/He J ve věku 4 až 6 týdnů, konkanavalin A (1,2 μg/ml), stejně jako 50 μl IL-1 (4 jednotky/ml, Aenzyme Inc), s následnou kultivací po dobu 48 hodin v inkubátoru při 37 °C s obsahem 5 % oxidu uhličitého. Poté se přidá H 3 -thymidin v koncentraci 0,5 μ. krychle palec /20 ul/jamka. Po kultivaci po dobu 18 hodin se buňky shromáždí na filtru ze skleněných vláken a množství3H-thymidinu zavedeného do buněk se měří kapalinovým scintilačním počítačem pro stanovení aktivity faktoru stimulujícího lymfocyty. Jak je znázorněno na obr. 25, přirozený APT neinhibuje aktivitu faktoru stimulujícího lymfocyty, ale zlepšený APT ji významně potlačuje. Při testování se samotným rozpouštědlem nebyl pozorován žádný účinek. Příklad 13 Protizánětlivá aktivita založená na denaturovaném proteinu. 1) Získání denaturovaného proteinu. Po inkubaci proteinového roztoku (5 mg/ml) v 0,1 N. roztok HCl nebo 0,1 N. roztokem NaOH při teplotě 37 o C po dobu 2-3 hodin, roztok proteinu se neutralizuje stejným množstvím NaOH nebo HCl. 2) Afinita vylepšeného APT (VI) k denaturovanému proteinu. Metoda: Podle postupu uvedeného níže se denaturovaný protein „přilepí“ na nitrocelulózový film. Potom se měří množství vylepšeného APT spojeného s ošetřením proteinem a nitrocelulózovým filmem, čímž se vyhodnotí afinita vylepšeného APT k denaturovanému proteinu. Kousek nitrocelulózového filmu se ponoří do 20 mM Tris-HCl pufrového roztoku, pH 7,5, obsahujícího 140 mM NaCl. Sušení. Denaturovaný protein (50 μg/10 μl) se po kapkách uvolní na kousek nitrocelulózového filmu. Sušení. Blokování 3% roztokem želatiny. Proplachování. Kousek nitrocelulózové fólie se ponoří do roztoku vylepšeného APT /1 μg/ml/. Proplachování. Přidá se plasminogen a syntetický substrát S-2251 a následuje inkubace při 37 °C (kvantitativní analýza absorbovaného pokročilého APT). Měření absorbance při 405 nm. Výsledky: Jak je uvedeno v tabulce 3, zlepšený APT vykazoval afinitu k imunoglobulinu G ošetřenému HCl, albuminu ošetřenému HCl a albuminu ošetřenému NaOH. Na druhé straně zlepšená APT nevykazuje afinitu k intaktnímu imunoglobulinu G a albuminu. 3) Aktivace zlepšeného APT (VI) denaturovaným proteinem. Metoda: k reakčnímu roztoku vylepšeného aktivátoru APT (denaturovaný protein, BrCN - zpracovaný fibrinogen atd.) se přidá plazminogen (0,0078 jednotek v 10 μl), 100 μl 3 mM syntetického substrátu S-2251 a různá množství pufru TBS. při různých koncentracích, čímž se získá 0,275 ml reakčního roztoku. K reakčnímu roztoku se přidá Advanced APT (2,5 n/g ve 25 ul) pro zahájení reakce. Po reakci po určitou dobu se k reakčnímu roztoku přidá 2% dodecylsulfát sodný (ekvimolární množství), aby se reakce zastavila. Měřením optické hustoty (OD 405) se určuje aktivita vylepšeného APT. Výsledky: Jak ukazuje obr. 26, albumin ošetřený NaOH a imunoglobulin G ošetřený HCl vykazovaly silný aktivační účinek zlepšeného APT. Zejména u imunoglobulinu G ošetřeného HCl je aktivace silná a aktivita imunoglobulinu G ošetřeného HCl je přibližně stejná jako aktivita fibrinogenu ošetřeného BrCN a v koncentraci, která je několikrát nižší. Intaktní albumin a imunoglobulin G nevykazují aktivaci. 4) Degradace denaturovaného proteinu pod vlivem zlepšeného APT (VI). Metoda: Po zreagování denaturovaného proteinu s vylepšeným APT za stejných podmínek jako v metodě popsané v předchozím pododstavci s tím rozdílem, že syntetický substrát S - 2251 není přidán do reakčního systému a množství denaturovaného proteinu je 133 μg/ ml, elektroforéza se provádí v polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným v přítomnosti -merkaptoethanolu. Výsledky: Jak ukazuje obr. 27, protein denaturovaný úpravou NaOH nebo úpravou HCL má za následek vymizení pásů ef-proteinu ze vzoru a tvorbu degradačních produktů, což ukazuje na jeho rozklad. Na druhou stranu, při použití intaktního albuminu nebyla po interakci se zlepšeným APT detekována žádná změna v ef-patternu, a proto nebyla detekována žádná degradace denaturovaného proteinu.

NÁROK

1. Rekombinantní tkáňový aktivátor plasminogenu s aminokyselinovou sekvencí uvedenou na str. kde Y je Glu-Ile-Lys;

H2N - amino konec;

COOH - karboxy konec;

R - přímá vazba nebo podobná sekvence obsahující substituce a/nebo delece a/nebo inzerce nesouvisející se změnami aktivity,

A mající následující vlastnosti: fibrinolytická aktivita, stanovená metodou rozpouštění 1 2 5 I-fibrinového filmu, schopnost aktivace fibrinem a aktivita zlepšeného tpA v nepřítomnosti fibrinu, která je nižší než aktivita fibrinu. přirozený tpA, prodloužený poločas ve srovnání s přírodní formou, zvýšený ve srovnání s přírodním tpA odolnost vůči kyselinám a teplu, schopnost inhibovat faktor aktivující lymfocyty a schopnost aktivace denaturovaným proteinem. 2. Způsob produkce rekombinantního tkáňového aktivátoru plasminogenu, zahrnující kultivaci hostitelských buněk transformovaných rekombinantní DNA obsahující sekvenci kódující analog tpA, a následnou purifikaci cílového produktu, vyznačující se tím, že hostitelské buňky jsou kultivovány transformované rekombinantním vektorem obsahujícím DNA sekvence kódující tpA klauzuli 1.