Rekombinantný tkanivový aktivátor plazminogénu označuje TPA (aktivátor tkanivového plazminogénu, faktor III, tromboplastín, tPA). Liečba pacientov v akútnom období

Obsah témy "Eozinofily. Monocyty. Trombocyty. Hemostáza. Systém zrážania krvi. Antikoagulačný systém.":
1. Eozinofily. Funkcie eozinofilov. Funkcie eozinofilných leukocytov. Eozinofília.
2. Monocyty. Makrofágy. Funkcie monocytov - makrofágov. Normálny počet monocytov - makrofágov.
3. Regulácia granulocytopoézy a monocytopoézy. Faktory stimulujúce kolónie granulocytov. Keylons.
4. Krvné doštičky. Štruktúra krvných doštičiek. Funkcie krvných doštičiek. Funkcie glykoproteínov. Zóna sólu - gél hyaloplazmy.
5. Trombocytopoéza. Regulácia trombocytopoézy. Trombopoetín (trombocytopoetín). Megakaryocyty. Trombocytopénia.
6. Hemostáza. Mechanizmy zrážania krvi. Hemostáza krvných doštičiek. Reakcia krvných doštičiek. Primárna hemostáza.
7. Systém zrážania krvi. Vonkajšia cesta na aktiváciu zrážania krvi. Faktory zrážania krvi.
8. Vnútorná cesta pre aktiváciu zrážania krvi. trombín.
9. Antikoagulačný krvný systém. Antikoagulačné mechanizmy krvi. antitrombín. heparín. Proteíny. Prostacyklín. trombomodulín.
10. Aktivátor tkanivového plazminogénu. Ektoenzýmy. Úloha endotelu v antikoagulačnom systéme. Tkanivový faktor. Inhibítor aktivátora plazminogénu. von Willebrandov faktor. Antikoagulanciá.

Aktivátor tkanivového plazminogénu. Ektoenzýmy. Úloha endotelu v antikoagulačnom systéme. Tkanivový faktor. Inhibítor aktivátora plazminogénu. von Willebrandov faktor. Antikoagulanciá.

Aktivátor tkanivového plazminogénu je proteín reprodukovaný a neustále vylučovaný vaskulárnym endotelom. Poskytuje priamu lokálnu trombolytickú aktivitu proti vytvorenému trombu. V krvi sa udržiava konštantná hladina tohto faktora, čo zabezpečuje systémovú trombolytickú aktivitu krvi.

Ektoenzýmy- Ide o endotelom produkovanú ADPázu, ATPázu a enzým konvertujúci adenozín. Endoteliálna ADPáza rýchlo rozkladá proagregant ADP, vylučovaný aktivovanými krvnými doštičkami.

Vaskulárne endotelové bunky syntetizovať a protrombotické faktory: tkanivového faktora, inhibítory aktivátora plazminogénu, von Willebrandov faktor.

Ryža. 7.11. Úloha endotelu krvných ciev pri zrážaní krvi. Pod nápisom „Antikoagulanciá“ sú endotelové faktory, ktoré majú antikoagulačný účinok v dôsledku inhibície agregácie krvných doštičiek, tvorby fibrínových zrazenín a aktivácie fibrinolýzy. Pod názvom „Prokoagulanciá“ sú označené endotelové faktory podieľajúce sa na tvorbe trombu krvných doštičiek, fibrínovej zrazenine a potláčaní fibrinolýzy (

Tkanivový faktor je komplexný proteín bunkovej membrány s hmotnosťou 46 kDa. Keď je bunka poškodená, časť jej molekuly sa pevne naviaže na koagulačný faktor Vila, čím podporuje jej funkciu urýchľovača vo vonkajšej koagulačnej dráhe.

Inhibítor aktivátora plazminogénu-I je 52 kDa proteín nachádzajúci sa v cirkulujúcej krvi. Tesnou väzbou na aktivátor plazminogénu ho inaktivuje, čím sa podieľa na regulácii fibrinolýzy v organizme.

von Willebrandov faktor je multidimenzionálna molekula s hmotnosťou 1-20 miliónov Da, syntetizovaná endotelom a uložená v endotelových sekrečných granulách. Uvoľňuje sa z nich, funguje ako adhezívna molekula pre krvné doštičky a podporuje ich agregáciu. Zvýšené uvoľňovanie von Willebrandovho faktora z endotelu je vyvolané trombínom.

Zrážanie krvi v cieve Hladký povrch endotelu tiež bráni inklúzii vnútornej dráhy pre tvorbu aktívnej protrombinázy. Monomolekulová proteínová vrstva adsorbovaná na povrchu endotelu odpudzuje zrážacie faktory a krvné doštičky a tiež zabraňuje zrážaniu krvi.

Antikoagulanciá použité v klinickej praxi. Napríklad na zníženie zvýšenej zrážanlivosti krvi u pacientov s koronárne ochorenie srdca, na udržanie krvi v tekutom stave pri použití kardiopulmonálneho bypassu, čo spôsobuje traumu krviniek, v dôsledku čoho sa aktivuje vnútorná dráha zrážania krvi.

farmakologický účinok

Trombolytické. Rekombinantný ľudský tkanivový aktivátor glykoproteínu plazminogénu.

Pri intravenóznom podaní je liek relatívne neaktívny v systémovom obehu. Aktivuje sa po naviazaní na fibrín, pričom indukuje premenu plazminogénu na plazmín, čo vedie k rozpusteniu fibrínovej zrazeniny.

Pri použití Aktilizovať je znížené uvoľňovanie enzýmu alfa-hydroxybutyrátdehydrogenázy.

Aplikácia Aktilizovať v dávke 100 mg počas 90 minút v kombinácii s iv heparínom u viac ako 40 000 pacientov s akútnym infarktom myokardu (štúdia GUSTO) viedla k zníženiu 30-dňovej mortality (6,3 %) v porovnaní s použitím streptokinázy (1,5 milióna jednotiek) počas 60 minút) súčasne so subkutánnym alebo intravenóznym podaním heparínu (7,3 %). Ukázalo sa, že po 60 minútach a 90 minútach trombolýzy u pacientov dostávajúcich Aktilizovať bola zistená vyššia frekvencia obnovy cievnej priechodnosti v infarktovej zóne ako pri použití streptokinázy. 180 minút po začiatku terapie a neskôr neboli zaznamenané žiadne rozdiely vo frekvencii priechodnosti ciev.

Pri použití Aktilizovať Došlo k zníženiu 30-dňovej mortality po infarkte myokardu v porovnaní s pacientmi, ktorí nedostávali trombolytickú liečbu.

U pacientov, ktorí dostávajú Aktilizovať v porovnaní s pacientmi, ktorí nedostávali trombolytickú liečbu, došlo k menej významnému poškodeniu všeobecná funkciaľavej komory srdca a lokálnej pohyblivosti steny.

Placebom kontrolovaná štúdia (LATE) ukázala, že použitie Aktilizovať v dávke 100 mg počas 3 hodín u pacientov s infarktom myokardu (v prípade začatia liečby do 6-12 hodín po nástupe symptómov) viedlo k zníženiu 30-dňovej mortality v porovnaní s placebom. Terapeutický účinok u pacientov s potvrdeným infarktom myokardu bol pozorovaný aj v prípadoch, keď sa liečba začala do 24 hodín po nástupe symptómov.

U pacientov s akútnou masívnou embóliou pľúcna tepna sprevádzané nestabilnou hemodynamikou, užívaním Aktilizovať vedie k rýchlemu zmenšeniu veľkosti trombu a zníženiu tlaku v pľúcnici, neexistujú však údaje o mortalite.

V dvoch štúdiách uskutočnených v USA (NINDS A/B), ktoré skúmali účinok lieku pri cievnej mozgovej príhode (v prvých 3 hodinách od nástupu symptómov), častejšie dosiahnutie priaznivého výsledku (žiadne postihnutie pacientov kapacita alebo minimálna závažnosť týchto porúch) v porovnaní s placebom.

Ak sa terapia začne neskôr, účinnosť lieku klesá, ako ukázali dve európske štúdie a ďalšia štúdia vykonaná v Spojených štátoch.

Výsledky metaanalýzy všetkých pacientov, ktorí dostali liečbu v priebehu prvých 3 hodín po nástupe cievnej mozgovej príhody, potvrdili prítomnosť pozitívneho účinku alteplázy.

Napriek zvýšenému riziku závažného a dokonca fatálneho intrakraniálneho krvácania bola pravdepodobnosť vývoja priaznivého výsledku liečby v porovnaní s placebom 14,9 % (95 % intervaly spoľahlivosti: 8,1 % a 21,7 %). Tieto údaje neumožňujú vyvodiť definitívne závery týkajúce sa účinku liečby na mortalitu. Pomer prínosu a rizika použitia alteplázy do 3 hodín od nástupu cievnej mozgovej príhody (s výhradou vyššie uvedených upozornení) sa vo všeobecnosti považuje za priaznivý, hoci údaje zo štúdií nie sú presvedčivé, pokiaľ ide o účinok liečby na mortalitu.

Metaanalýza všetkých dostupných klinických údajov ukazuje, že altepláza je menej účinná u pacientov, ktorých liečba sa začína 3-6 hodín po nástupe symptómov v porovnaní s liečbou začatou do 3 hodín po nástupe klinických prejavov. Okrem toho je riziko komplikácií liečby cievnej mozgovej príhody v prvom prípade vyššie, čo vedie k nepriaznivému pomeru prínos/riziko.

Vzhľadom na svoju relatívnu špecifickosť pre fibrín vedie altepláza 100 mg k miernemu zníženiu hladín cirkulujúceho fibrinogénu (na približne 60 % po 4 hodinách), ktoré sa zvyčajne zvýšia o viac ako 80 % po 24 hodinách. Koncentrácie plazminogénu a alfa-2-antiplazmínu sa po 4 hodinách znížia na 20 % a 35 % počiatočných hladín a po 24 hodinách sa opäť zvýšia na viac ako 80 %. Významný a dlhotrvajúci pokles hladín cirkulujúceho fibrinogénu bol pozorovaný len u malého počtu pacientov.

Farmakokinetika

Aktilizovať Rýchlo sa vylučuje z krvného obehu a metabolizuje sa hlavne v pečeni. Plazmatický klírens liečiva je 550-680 ml/min.

T 1/2 v α-fáze je 4-5 minút. To znamená, že po 20 minútach bude v plazme menej ako 10 % počiatočného množstva liečiva. Pre zostávajúce množstvo liečiva je T1/2 v β-fáze asi 40 minút.

Indikácie

- trombolytická liečba akútneho infarktu myokardu počas prvých 6 hodín po rozvoj symptómov(90-minútový / zrýchlený / dávkovací režim);

- trombolytická liečba akútneho infarktu myokardu v období od 6 do 12 hodín po vzniku symptómov (3-hodinový dávkovací režim);

- trombolytická liečba akútnej masívnej pľúcnej embólie sprevádzanej nestabilnou hemodynamikou, diagnóza by sa mala, ak je to možné, objektívne potvrdiť (napríklad pľúcna angiografia alebo neinvazívne metódy, napríklad pľúcna tomografia). Klinické štúdie týkajúce sa úmrtnosti a dlhodobých výsledkov liečby pľúcnej embólie sa neuskutočnili;

- trombolytická liečba akútnej ischemickej cievnej mozgovej príhody (indikovaná len vtedy, ak je predpísaná do 3 hodín po nástupe symptómov cievnej mozgovej príhody a ak je pomocou vhodných zobrazovacích metód vylúčené intrakraniálne krvácanie / hemoragická cievna mozgová príhoda/, napr. Počítačová tomografia mozog).

Dávkovací režim

Aktilizovať sa má použiť čo najskôr po nástupe príznakov.

O infarkt myokardu s 90-minútovým (zrýchleným) dávkovacím režimom pre pacientov, u ktorých možno liečbu začať do 6 hodín od nástupu symptómov, liek sa predpisuje v dávke 15 mg IV bolus, potom 50 mg ako IV infúzia počas prvých 30 minút, po ktorej nasleduje infúzia 35 mg počas 60 minút, kým sa nedosiahne maximálna dávka 100 mg.

Dávka lieku sa má vypočítať v závislosti od telesnej hmotnosti. Spočiatku sa liek predpisuje v dávke 15 mg IV bolusu, potom 750 mcg / kg telesnej hmotnosti (maximálne 50 mg) počas 30 minút intravenóznym kvapkaním, po ktorom nasleduje infúzia 500 mcg / kg (maximálne 35 mg) počas 60 minút.

O infarkt myokardu s 3-hodinovým dávkovacím režimom pre pacientov, u ktorých možno liečbu začať medzi 6. a 12. hodinou po nástupe symptómov, liek sa predpisuje v dávke 10 mg IV bolus, potom 50 mg ako IV infúzia počas prvej hodiny, po ktorej nasleduje IV infúzia 10 mg počas 30 minút, kým sa nedosiahne maximálna dávka 100 mg v priebehu 3 hodín.

U pacientov s telesnou hmotnosťou nižšou ako 65 kg celková dávka nemá prekročiť 1,5 mg/kg.

Pomocná terapia: kyselina acetylsalicylová sa má predpísať čo najskôr po vzniku trombózy a pokračovať v nej počas prvých mesiacov po infarkte myokardu. Odporúčaná dávka je 160-300 mg/deň. Súčasne by sa malo začať s užívaním heparínu na obdobie 24 hodín alebo dlhšie (pri zrýchlenom dávkovacom režime - najmenej 48 hodín). Pred začatím trombolytickej liečby sa odporúča začať s intravenóznym bolusovým podaním heparínu v dávke 5000 U/h. Následne sa heparín podáva infúziou rýchlosťou 1000 jednotiek/hodinu. Dávka heparínu sa má upraviť v závislosti od výsledkov opakovaného stanovenia aPTT (hodnoty by mali prekročiť počiatočnú hladinu 1,5-2,5 krát).

O pľúcna embólia Aktilizovať podávané v celkovej dávke 100 mg počas 2 hodín.Najväčšie skúsenosti sa získali pri použití nasledujúceho dávkovacieho režimu: najprv sa liek predpisuje v dávke 10 mg i.v. v boluse na 1-2 minúty, potom 90 mg i.v. v kvapkaní počas 2 hodín .U pacientov s telesnou hmotnosťou nižšou ako 65 kg celková dávka nemá prekročiť 1,5 mg/kg telesnej hmotnosti.

Pomocná terapia: po použití Aktilizovať Ak je APTT nižší ako 2-násobok východiskovej hodnoty, má sa predpísať heparín (alebo v ňom pokračovať). Ďalšia infúzia sa tiež uskutočňuje pod kontrolou APTT, ktorá by mala prekročiť počiatočnú hladinu 1,5-2,5-krát.

O akútna ischemická mozgová príhoda Odporúčaná dávka je 900 mcg/kg (maximálne 90 mg) vo forme intravenóznej infúzie do 60 minút po úvodnej intravenóznej bolusovej injekcii dávky liečiva rovnajúcej sa 10 % celkovej dávky. Liečba sa má začať čo najskôr po nástupe príznakov (najlepšie do 3 hodín).

Pomocná terapia: Bezpečnosť a účinnosť vyššie uvedeného liečebného režimu, používaného v kombinácii s heparínom a kyselinou acetylsalicylovou počas prvých 24 hodín po nástupe symptómov, neboli dostatočne preskúmané. V tomto ohľade v prvých 24 hodinách od začiatku terapie Aktilizovať treba sa vyhnúť použitiu kyseliny acetylsalicylovej alebo intravenózneho heparínu. Ak je použitie heparínu potrebné na iné indikácie (napríklad na prevenciu hlbokej žilovej trombózy), jeho dávka by nemala prekročiť 10 000 IU denne a liek sa podáva subkutánne.

Pravidlá na prípravu infúzneho roztoku

Lyofilizovaný prášok obsiahnutý v injekčnej liekovke (50 mg) sa rozpustí za sterilných podmienok v 50 ml vody na injekciu. Konečná koncentrácia alteplázy je 1 mg/ml.

Výsledný roztok sa môže zriediť sterilným fyziologickým roztokom (0,9 %) na minimálna koncentrácia altepláza 0,2 mg/ml.

Pôvodne získaný roztok nie je možné riediť vodou na injekciu alebo infúznymi roztokmi na báze uhľohydrátov, napríklad dextrózy.

Po zriedení sa výsledný roztok podáva intravenózne, ako je opísané vyššie.

Vedľajší účinok

Najbežnejší vedľajší účinok je krvácanie vedúce k zníženiu hematokritu a/alebo hemoglobínu.

Krvácanie spojené s trombolytickou liečbou možno rozdeliť do dvoch hlavných kategórií:

- vonkajšie krvácanie (zvyčajne z miest vpichu alebo poškodenia krvných ciev);

- vnútorné krvácanie z gastrointestinálneho traktu, urogenitálneho traktu, krvácanie do retroperitoneálneho priestoru, krvácanie do mozgu alebo krvácanie z parenchýmových orgánov.

Nižšie uvedené údaje sú založené na výsledkoch klinických štúdií Aktilizovať u 8299 pacientov s akútnym infarktom myokardu.

Prípad embolizácie kryštálov cholesterolu, ktorý nebol pozorovaný v populácii z klinických štúdií, je založený na izolovanej správe.

V porovnaní so štúdiami s infarktom myokardu bol počet pacientov s pľúcnou embóliou a mozgovou príhodou, ktorí sa zúčastnili klinických štúdií (do 0-3 hodín od nástupu symptómov týchto ochorení), veľmi malý. Preto malé číselné rozdiely zaznamenané v porovnaní s údajmi získanými pri infarkte myokardu boli s najväčšou pravdepodobnosťou dôsledkom malej veľkosti vzorky. Okrem intrakraniálneho krvácania (ako vedľajšieho účinku pri mozgovej príhode) a reperfúznych arytmií (ako vedľajšieho účinku pri infarkte myokardu) neexistuje žiadny klinický dôvod predpokladať kvalitatívne a kvantitatívne rozdiely v spektre vedľajšie účinky liek Aktilizovať v prípade jeho použitia pri pľúcnej embólii a akútnej ischemickej cievnej mozgovej príhode, alebo pri infarkte myokardu.

Vedľajšie účinky zaznamenané pri použití na infarkt myokardu

Často: reperfúzne arytmie, ktoré môžu byť život ohrozujúce a vyžadujú použitie konvenčnej antiarytmickej liečby.

Vedľajšie účinky zaznamenané pri použití na infarkt myokardu a pľúcnu embóliu

Zriedka: intrakraniálne krvácanie.

Vedľajšie účinky zaznamenané pri použití pri akútnej ischemickej cievnej mozgovej príhode

Často: intrakraniálne krvácanie. Hlavnou nežiaducou udalosťou bolo klinicky významné intrakraniálne krvácanie (ich frekvencia dosahovala 10 %). Nezistilo sa však žiadne zvýšenie miery komplikácií alebo celkovej mortality.

Vedľajšie účinky zaznamenané pri použití pri infarkte myokardu, pľúcnej embólii a akútnej ischemickej cievnej mozgovej príhode

Často: vonkajšie krvácanie, zvyčajne z miest vpichu alebo z poškodených ciev, znížený krvný tlak.

Často: gastrointestinálne krvácanie, nevoľnosť, vracanie (nevoľnosť a vracanie môžu byť aj príznakmi infarktu myokardu), zvýšená telesná teplota, krvácanie z urogenitálneho traktu, krvácanie z nosa, ekchymóza.

Zriedkavo: krvácania v retroperitoneálnom priestore, krvácanie z ďasien, tromboembolizmus, ktorý môže byť sprevádzaný zodpovedajúcimi následkami na strane postihnutých vnútorné orgány. Boli pozorované anafylaktoidné reakcie (zvyčajne mierne, ale v niektorých prípadoch môžu byť život ohrozujúce); Možná vyrážka, žihľavka, bronchospazmus, angioedém, hypotenzia, šok alebo akákoľvek iná alergická reakcia. Ak sa tieto reakcie vyvinú, má sa použiť konvenčná antialergická liečba. Zistilo sa, že u pomerne veľkej časti pacientov s takýmito reakciami boli súčasne použité ACE inhibítory. Anafylaktické reakcie(t.j. v dôsledku IgE) pre Aktilizovať neznámy.

Zriedka: prechodná tvorba protilátok proti Aktilizovať (v nízkych titroch), ale klinický význam tohto javu nebol stanovený; embolizácia s kryštálmi cholesterolu, čo môže viesť k zodpovedajúcim následkom z postihnutých vnútorných orgánov; krvácanie z parenchýmových orgánov.

Často boli potrebné transfúzie krvi.

Kontraindikácie

- hemoragická diatéza;

- významné krvácanie v súčasnosti alebo počas predchádzajúcich 6 mesiacov;

— simultánne podávanie perorálne antikoagulanciá, ako je warfarín (medzinárodný normalizovaný pomer > 1,3);

- anamnéza chorôb centrálneho nervového systému (vrátane novotvarov, aneuryzmy);

- operácia na hlave resp miecha;

- intrakraniálne (vrátane subarachnoidálneho) krvácanie v súčasnosti alebo v anamnéze;

- podozrenie na hemoragickú mŕtvicu;

- ťažké nekontrolovateľné arteriálnej hypertenzie;

- veľký chirurgický zákrok alebo ťažká trauma počas predchádzajúcich 10 dní (vrátane akejkoľvek traumy v kombinácii s týmto akútnym infarktom myokardu);

- nedávne traumatické poranenie mozgu;

- predĺžená alebo traumatická kardiopulmonálna resuscitácia (viac ako 2 minúty), pôrod počas predchádzajúcich 10 dní;

- nedávne prepichnutie nestlačiteľných krvných ciev (napríklad podkľúčových a krčná žila);

- hemoragická retinopatia (vrátane diabetes mellitus), ktorá môže byť indikovaná poruchou zraku;

- iné hemoragické ochorenia oka;

- bakteriálna endokarditída;

- perikarditída;

— akútna pankreatitída;

- potvrdený žalúdočný vred a dvanástnik za posledné 3 mesiace;

- závažné ochorenia pečene, vrátane zlyhanie pečene, cirhóza pečene, portálna hypertenzia(S kŕčové žily ezofágové žily), aktívna hepatitída;

- arteriálne aneuryzmy, vrodené chyby rozvoj tepien a žíl;

- novotvary so zvýšeným rizikom krvácania;

- precitlivenosť na zložky lieku.

V prípade použitia lieku na liečbu akútneho infarktu myokardu a pľúcnej embólie existujú okrem vyššie uvedených kontraindikácií aj tieto kontraindikácie:

- mŕtvica v anamnéze.

Pri použití lieku na liečbu akútnej ischemickej cievnej mozgovej príhody existujú okrem vyššie uvedených kontraindikácií aj tieto kontraindikácie:

- nástup príznakov ischemickej cievnej mozgovej príhody viac ako 3 hodiny pred začiatkom infúzie alebo nedostatok presných informácií o čase nástupu ochorenia;

- rýchle zlepšenie akútnej ischemickej cievnej mozgovej príhody alebo miernych symptómov v čase infúzie;

- závažná mozgová príhoda na základe klinických údajov (napríklad ak NIHSS>25) a/alebo podľa výsledkov vhodných zobrazovacích metód;

- kŕče na začiatku mŕtvice;

- informácie o utrpel mŕtvicu alebo vážne poranenie hlavy počas predchádzajúcich 3 mesiacov;

- výskyt predchádzajúcej mozgovej príhody na pozadí cukrovka;

- použitie heparínu do 48 hodín pred nástupom cievnej mozgovej príhody, ak je aktivovaný parciálny trombínový čas (aPTT) v tom čase zvýšený;

- použitie protidoštičkových látok v čase infúzie a 24 hodín po infúzii;

— počet krvných doštičiek menej ako 100 000/μl;

- systolický krvný tlak nad 185 mm Hg. Art., alebo diastolický krvný tlak nad 110 mm Hg. Art., alebo prihláška je potrebná intenzívna starostlivosť(iv podávanie liekov) na zníženie krvného tlaku na tieto limity;

- hladina glukózy v krvi je nižšia ako 50 mg/dl alebo vyššia ako 400 mg/dl.

Droga Aktilizovať nie je indikovaný na liečbu akútnej cievnej mozgovej príhody u detí a dospievajúcich mladších ako 18 rokov a u dospelých nad 80 rokov.

Užívanie počas tehotenstva a dojčenia

Klinická skúsenosť Aktilizovať obmedzené počas tehotenstva a laktácie. Otázka izolácie alteplázy z materské mlieko neštudoval.

Ak je potrebné použiť liek (pri ochoreniach, ktoré sú priamo život ohrozujúce) počas tehotenstva a dojčenia, je potrebné posúdiť očakávaný prínos liečby pre matku a potenciálne riziko pre plod alebo dojča. V tomto smere použitie Aktilizovať počas tehotenstva a počas dojčenie Neodporúčané.

Použitie pri dysfunkcii pečene

Liek je kontraindikovaný pri závažných ochoreniach pečene, vrátane zlyhania pečene, cirhózy pečene, portálnej hypertenzie (s pažerákovými varixami), aktívnej hepatitídy.

špeciálne pokyny

IN nasledujúce prípady po dohode Aktilizovať stupeň očakávaného prínosu a možné riziko krvácania sa má starostlivo posúdiť:

- nedávna intramuskulárna injekcia alebo menšie nedávne zákroky, ako je biopsia, punkcia veľké nádoby, masáž srdca počas resuscitácie;

- ochorenia (neuvedené v zozname kontraindikácií), pri ktorých je zvýšené riziko krvácania.

Pri liečbe akútneho infarktu myokardu a akútnej pľúcnej embólie sa má liek používať opatrne:

- so systolickým krvným tlakom nad 160 mm Hg;

- v starobe, keď sa môže zvýšiť riziko vnútrolebkového krvácania. Keďže starší pacienti majú väčšiu pravdepodobnosť pozitívny výsledok túto liečbu sa tiež zvyšuje, je potrebné starostlivé posúdenie pomeru prínos/riziko.

Pri liečbe akútnej ischemickej cievnej mozgovej príhody sa má liek používať opatrne, pretože aplikácie Aktilizovať u tejto kategórie pacientov (v porovnaní s použitím tohto lieku na iné indikácie) je sprevádzané výrazne zvýšeným rizikom intrakraniálneho krvácania, pretože krvácanie sa vyskytuje prevažne v nekrotickej oblasti.

Toto by sa malo brať do úvahy najmä v nasledujúcich prípadoch:

- všetky stavy uvedené v časti „Kontraindikácie“ a vo všeobecnosti všetky stavy charakterizované vysokým rizikom krvácania;

— prítomnosť malých asymptomatických aneuryziem mozgových ciev;

- u pacientov, ktorí boli predtým liečení kyselinou acetylsalicylovou alebo inými protidoštičkovými liekmi, môže byť zvýšené riziko intracerebrálneho krvácania, najmä ak Aktilizovať začala neskôr. Vzhľadom na zvýšené riziko cerebrálneho krvácania by dávka alteplázy nemala prekročiť 900 mcg/kg (maximálna dávka je 90 mg).

Liečba sa nemá začať neskôr ako 3 hodiny po nástupe symptómov z dôvodu nepriaznivého pomeru prínos/riziko v dôsledku nasledujúcich okolností:

— pozitívny účinok liečby klesá s neskorým začatím liečby;

— zvýšenie úmrtnosti hlavne u pacientov, ktorí predtým dostávali kyselinu acetylsalicylovú;

- zvýšené riziko krvácania.

Liečba Aktilizovať má vykonávať lekár so skúsenosťami s trombolytickou liečbou a so schopnosťou monitorovať jej účinnosť. Použitím Aktilizovať Odporúča sa mať k dispozícii štandardné resuscitačné vybavenie a vhodné lieky.

Najčastejšia komplikácia terapie Aktilizovať krváca. Súbežné užívanie heparínu môže podporiť krvácanie. Pretože Aktilizovať rozpúšťa fibrín, môže dôjsť ku krvácaniu z nedávnych miest vpichu. Preto trombolytická liečba vyžaduje starostlivé sledovanie oblastí možného krvácania (vrátane miest zavedenia katétra, arteriálnych a venóznych punkcií, rezov a injekcií). Počas liečby je potrebné vyhnúť sa používaniu pevných katétrov, intramuskulárnych injekcií a zbytočným manipuláciám. Aktilizovať .

V prípade závažného krvácania, najmä cerebrálneho krvácania, je potrebné okamžite ukončiť fibrinolytickú liečbu, ako aj použitie heparínu. Ak bol heparín použitý do 4 hodín pred začiatkom krvácania, treba zvážiť vhodnosť použitia protamínu. IN v ojedinelých prípadoch Ak sú vyššie uvedené konzervatívne opatrenia neúčinné, môže byť indikované použitie krvných produktov. Transfúzne podanie kryoprecipitátu, čerstvej zmrazenej plazmy a trombocytov možno predpísať v súlade s klinickými a laboratórnymi parametrami, stanovenými opakovane po každom podaní. Odporúča sa vykonávať infúziu kryoprecipitátu, kým koncentrácia fibrinogénu nedosiahne 1 g/l. Môžu sa zvážiť antifibrinolytické látky (napr. kyselina tranexamová), ale špecifické štúdie sa neuskutočnili.

V prípade akútneho infarktu myokardu a pľúcnej embólie sa nemá používať. Aktilizovať v dávke presahujúcej 100 mg a v prípade akútnej ischemickej cievnej mozgovej príhody - v dávke vyššej ako 90 mg, pretože zvyšuje sa riziko intrakraniálneho krvácania.

Po ukončení liečby sa nepozorovala trvalá tvorba protilátok proti rekombinantnému ľudskému tkanivovému aktivátoru plazminogénu. Systematizované skúsenosti s opätovným použitím Aktilizovať nie je k dispozícií. Ak dôjde k anafylaktoidnej reakcii, infúzia sa má zastaviť a podať vhodná liečba. Odporúča sa pravidelné sledovanie znášanlivosti liečby, najmä u pacientov, ktorí súbežne užívajú ACE inhibítory.

Pri liečbe akútneho infarktu myokardu je potrebné mať na pamäti aj nasledujúce preventívne opatrenia:

- koronárna trombolýza môže viesť k arytmii spojenej s reperfúziou;

— nie sú skúsenosti s použitím antagonistov glykoproteínu IIb/IIIa počas prvých 24 hodín od začiatku liečby;

- použitie trombolytických látok môže zvýšiť riziko tromboembólie u pacientov s trombózou ľavého srdca, napríklad s mitrálnou stenózou alebo fibriláciou predsiení.

Pri liečbe akútnej ischemickej cievnej mozgovej príhody je potrebné mať na pamäti aj nasledujúce opatrenia.

Liečbu by mal vykonávať výlučne skúsený lekár so zručnosťami a skúsenosťami s poskytovaním intenzívnej neurologickej starostlivosti na špecializovanom oddelení, ktoré má schopnosť vykonávať celú škálu neurozobrazovacích štúdií.

Počas liečby a 24 hodín po jej ukončení je potrebné sledovať krvný tlak. Keď sa systolický krvný tlak zvýši nad 180 mm Hg. alebo diastolický krvný tlak pod 105 mm Hg. Odporúča sa IV použitie antihypertenzív.

Terapeutický účinok je znížený u pacientov, ktorí v minulosti prekonali mozgovú príhodu alebo v prítomnosti nekontrolovaného diabetes mellitus. U takýchto pacientov sa pomer prínos/riziko považuje za menej priaznivý, aj keď stále zostáva pozitívny. U pacientov s veľmi malými mozgovými príhodami riziko prevažuje nad očakávaným prínosom, preto ho používajte Aktilizovať Neodporúčané.

Pacienti s veľmi ťažkou mozgovou príhodou majú zvýšené riziko intrakraniálneho krvácania a smrti. V týchto prípadoch Aktilizovať by sa nemali používať.

Pacienti s rozsiahlymi mozgovými infarktmi majú zvýšené riziko nepriaznivého výsledku, vr. ťažké intracerebrálne krvácanie a smrť. V takýchto prípadoch je potrebné starostlivo zvážiť riziká a prínosy liečby.

V prípade cievnej mozgovej príhody sa pravdepodobnosť priaznivého výsledku liečby znižuje so zvyšujúcim sa vekom, ako aj so zvyšujúcou sa závažnosťou cievnej mozgovej príhody a s zvýšené hladiny krvná glukóza. Pravdepodobnosť vážneho postihnutia a smrti alebo závažného intrakraniálneho krvácania sa však zvyšuje bez ohľadu na liečbu. Aktilizovať sa nemá používať u pacientov starších ako 80 rokov, v prípadoch závažnej mozgovej príhody (podľa klinických nálezov a/alebo zobrazovacích štúdií) a v prípadoch, keď sú východiskové hodnoty glukózy v krvi nižšie ako 50 mg/dl alebo vyššie ako 400 mg/dl.

Reperfúzia ischemickej oblasti môže viesť k edému mozgu v oblasti infarktu. Kvôli zvýšenému riziku krvácania sa inhibítory agregácie trombocytov nemajú začať podávať počas prvých 24 hodín po trombolýze alteplázou.

Použitie v pediatrii

Aktuálne skúsenosti s Aktilizovať obmedzené u detí.

Predávkovanie

Symptómy: Napriek relatívnej špecifickosti pre fibrín môže predávkovanie spôsobiť klinicky významný pokles fibrinogénu a koagulačných faktorov.

Liečba: vo väčšine prípadov postačuje vyčkávací prístup s očakávaním fyziologickej regenerácie týchto faktorov po ukončení podávania Aktilizovať . Ak dôjde k závažnému krvácaniu, odporúča sa transfúzia čerstvej zmrazenej plazmy alebo čerstvej plnej krvi a v prípade potreby možno predpísať syntetické antifibrinolytiká.

Liekové interakcie

Špeciálne interakčné štúdie Aktilizovať nebol testovaný s inými liekmi bežne používanými pri akútnom infarkte myokardu.

Užívanie liekov, ktoré ovplyvňujú zrážanlivosť krvi alebo menia funkciu krvných doštičiek pred, počas alebo po začatí liečby Aktilizovať môže zvýšiť riziko krvácania.

Súbežné užívanie ACE inhibítorov môže zvýšiť riziko anafylaktoidných reakcií. Tieto reakcie boli pozorované u relatívne veľkej časti pacientov užívajúcich ACE inhibítory.

Farmaceutické interakcie

Droga Aktilizovať sa nesmie miešať s inými liekmi (dokonca ani s heparínom), a to ani v infúznej fľaši ani v nej spoločný systém na intravenózne podanie.

Podmienky výdaja z lekární

Liek je dostupný na lekársky predpis.

Podmienky a lehoty skladovania

Liek sa má uchovávať na mieste chránenom pred svetlom, mimo dosahu detí, pri teplote neprevyšujúcej 25°C. Čas použiteľnosti - 3 roky.

Pripravený roztok sa môže uchovávať v chladničke až 24 hodín; pri teplote nepresahujúcej 25°C - do 8 hodín.

Aktivátor tkanivového plazminogénu je proteín patriaci do skupiny secernovaných proteáz. Premieňa plazminogén na aktívna forma– plazmín.

Altepláza (actylise)– rekombinantný ľudský tkanivový aktivátor plazminogénu

Lyofilizovaný prášok na roztok: 50 mg vo fľaši s rozpúšťadlom (100 ml).

Vzhľadom na nedostatočnú antigenicitu sa môže podávať opakovane, aj po predchádzajúcej liečbe streptokinázou, a má vysoký tropizmus pre trombofibrín.

Štandardný režim podávania: bolusové podanie 15 mg liečiva, po ktorom nasleduje kvapková infúzia 50 mg počas 30 minút a 35 mg počas ďalšej hodiny.

Reteplase- trombolytikum tretej generácie. Polčas rozpadu lieku je výrazne dlhší v porovnaní s jeho predchodcami, čo umožňuje jeho intravenózne podanie v dvoch dávkach (10 IU s intervalom 30 minút).

Tenektepláza (metalizácia)- trombolytikum tretej generácie.

Má vysokú selektivitu, zvýšenú odolnosť voči plazminogénovému antiaktivátoru-1 a dlhý polčas. Vďaka týmto vlastnostiam sa tenektepláza môže podávať ako jeden bolus. Dávka tenekteplázy závisí od hmotnosti a je asi 30-50 mg (0,53 mg/kg).

Vzhľadom na možnosť bolusového podania je vhodné užívať liek na prednemocničné štádium(zlatý štandard prednemocničnej trombolýzy).

Indikácie pre trombolýzu:

1. EKG odhalí vzostup ST intervalu o viac ako 1 mm v dvoch alebo viacerých susedných zvodoch (vo V 1-3 je vzostup ST viac ako 2 mm) alebo prítomnosť akútnej blokády ľavého ramienka (pravdepodobne keď subtotálna oklúzia koronárnej artérie progreduje do totálnej), alebo idioventrikulárny rytmus.

2. Prvých 6 hodín infarktu myokardu.

3. Prvých 12 hodín infarktu myokardu s pretrvávajúcou bolesťou, eleváciou segmentu ST a absenciou vlny Q, ak infarkt myokardu nie je úplný a je tam „mozaika“ klinický obraz Rozhodnutie vykonať trombolýzu po 12 hodinách sa robí na základe klinického obrazu, anamnézy a EKG.

Kontraindikácie trombolýzy:

Absolútne:

· Predchádzajúca hemoragická mŕtvica.

· Štrukturálne cerebrálne vaskulárne lézie (arteriovenózna malformácia)

· Malígne nádory mozgu (primárne alebo metastatické).

· Ischemická cievna mozgová príhoda počas predchádzajúcich 3 mesiacov.

· Podozrenie na disekčnú aneuryzmu aorty.

· Akútne krvácanie alebo hemoragická diatéza.

· Traumatické poranenie mozgu alebo neurochirurgický zásah na mozgu alebo mieche resp oblasť tváre lebky počas predchádzajúcich 3 mesiacov.

· Alergické reakcie anamnéza trombolytickej liečby.

Relatívna

Závažná, nedostatočne kontrolovaná hypertenzia v anamnéze

· Ťažká nekontrolovaná arteriálna hypertenzia pri prijatí (TK viac ako 180/110 mmHg).

· Porušenia cerebrálny obeh pred viac ako 3 mesiacmi, demencia alebo intrakraniálna patológia, ktorá nie je uvedená v absolútnych kontraindikáciách.

· Užívanie nepriamych antikoagulancií s vysokým INR (3-4).

· Dlhé (viac ako 10 minút) vedenie resuscitačné opatrenia počas predchádzajúcich 3 týždňov.

· Chirurgická intervencia počas predchádzajúcich 3 týždňov.

· Vnútorné krvácanie pred 2-4 týždňami.

· Tehotenstvo.

· Peptický vredžalúdka alebo dvanástnika v akútnej fáze.

· Ťažké ochorenia pečene.

Kritériá účinnosti koronárnej reperfúzie

Angiografické:

Stupeň 0 – bez prietoku krvi: kontrastná látka neprechádza pod miesto trombózy;

I. stupeň – minimálny prietok krvi: kontrastná látka čiastočne preniká pod miesto uzáveru, ale nevypĺňa koronárne lôžko;

II stupeň - čiastočný prietok krvi: kontrastná látka prechádza miestom oklúzie, plní koronárnej artérie, ale pomalšie ako v bežných plavidlách;

III stupeň - úplné obnovenie priechodnosti: kontrastná látka naplní a uvoľní koronárnu artériu rovnakou rýchlosťou ako nad miestom uzáveru.

Neinvazívne:

Rýchla dynamika úseku ST: pokles úseku ST vo zvode s najväčším vzostupom o 50 % a viac po 1,5 hodine od začiatku trombolýzy.

Poruchy reperfúzneho rytmu. Za najinformatívnejšie sa považuje zrýchlený idioventrikulárny rytmus a neskoré komorové extrasystoly do 2-3 hodín od začiatku trombolýzy.

Rýchla dynamika biochemických markerov nekrózy. Za biochemické kritériá pre reperfúziu sa považuje viacnásobné zvýšenie hladiny markerov nekrózy v krvi 90-120 minút od začiatku trombolýzy (fenomén „vymývania“) s dosiahnutím maximálnych hladín celkovej CPK do 12 hodín, CPK-MB - do 6 hodín, myoglobín - do 3 hodín od začiatku trombolýzy.

Rýchly pokles intenzity alebo úplná úľava syndróm bolesti do 60. minúty od začiatku trombolýzy.

NIEKTORÉ ASPEKTY MEDIKÁCIE

LIEČBA PACIENTOV V AKÚTNOM OBDOBÍ

INFARKT MYOKARDU

Lieky, predpísané počas ischémie, znižujú spotrebu kyslíka myokardom (znižujú srdcovú frekvenciu, krvný tlak a kontraktilitu ľavej komory) a/alebo spôsobujú vazodilatáciu.

liečba β-blokátormi

Hlavné mechanizmy účinku β-blokátorov sú:

Antihypertenzívny účinok. Súvisí s inhibíciou sekrécie renínu a tvorby angiotenzínu II, blokádou presynaptických β-adrenergných receptorov, ktoré zvyšujú uvoľňovanie norepinefrínu zo sympatických nervových zakončení, a so znížením centrálnej vazomotorickej aktivity. K poklesu produkcie renínu, ako aj angiotenzínu II a aldosterónu dochádza aj blokádou β1-adrenergných receptorov v juxtaglomerulárnom aparáte obličiek.

Antiischemický účinok. Betablokátory znižujú spotrebu kyslíka myokardom znížením srdcovej frekvencie, kontraktility myokardu a systolického tlaku krvný tlak. Okrem toho predĺženie diastoly spôsobené znížením srdcovej frekvencie môže poskytnúť zvýšenie perfúzie myokardu.

Antiarytmický účinok. Výsledkom priamych elektrofyziologických účinkov na srdce (zníženie srdcovej frekvencie, pokles spontánnych impulzov ektopických kardiostimulátorov, spomalenie vedenia vzruchu a zvýšenie refraktérnej periódy atrioventrikulárneho uzla) dochádza k zníženiu sympatikových vplyvov a ischémie myokardu, k zlepšeniu funkcia baroreflexu a prevencia hypokaliémie vyvolanej katecholamínmi.

Dochádza k zlepšeniu koronárneho prietoku krvi v dôsledku predĺženia diastoly. Zlepšenie metabolizmu myokardu - v dôsledku inhibície uvoľňovania katecholamínov vyvolaného voľným mastné kyseliny z tukového tkaniva; obnovenie citlivosti β-adrenergných receptorov; zníženie oxidačného stresu v myokarde.

Betablokátory sa líšia rozpustnosťou vo vode a lipidoch. Produkty rozpustné v tukoch(propranolol, metoprolol, oxprenolol, bisoprolol) sa ľahko vstrebávajú do gastrointestinálny trakt sa rýchlo metabolizujú v pečeni, majú veľké distribučné objemy a dobre prenikajú cez hematoencefalickú bariéru. Naproti tomu vo vode rozpustné β-blokátory (acebutolol, atenolol, betaxolol, carteolol, esmolol, nadolol, sotalol) sa horšie vstrebávajú, metabolizujú sa pomalšie a majú dlhší polčas. Preto sa vo vode rozpustné lieky môžu užívať raz denne.

Pri poruche funkcie pečene sa predlžuje polčas β-blokátorov rozpustných v tukoch a pri poruche funkcie obličiek sa predlžuje polčas rozpadu vo vode rozpustných. To je základ pre výber liekov v tejto skupine u pacientov so zlyhaním pečene a obličiek.

S nestabilnou hemodynamikou(vysoké riziko nedostatočne kontrolovaného krvného tlaku, napr. v akútnych alebo akútnych obdobiach infarktu myokardu) je racionálne použiť krátkodobo pôsobiace betablokátory, ktoré umožňujú kontrolu klinické prejavy choroby.

Tab. Anaprilini 20 mg 1 tableta 3-4 krát denne.

Sol. Anaprilini 0,25% roztok 1 ml (2,5 mg) zriedený 1:10 v 0,9% roztoku NaCl intravenózne pomaly vo frakciách, počnúc 1 mg, potom v závislosti od účinku a znášanlivosti zvýšenie dávky na 5-10 mg.

So stabilnou hemodynamikou v akútnom období infarktu myokardu sa odporúča predpísať dlhodobo pôsobiace betablokátory podľa nasledujúcej schémy:

Sol. Metoprolol 0,1 % 5 ml (5 mg) zriedený 1:10 v 0,9 % roztoku NaCl intravenózne pomaly vo frakčných krokoch počas 2 minút; opakujte 5 mg po 5 minútach; ďalších 5 mg – po ďalších 5 minútach; 15 minút po poslednej dávke 25-50 mg perorálne každých 12 hodín.

V akútnom a subakútnom období infarktu myokardu sa používajú nasledujúce dlhodobo pôsobiace β-blokátory.

Tab. Atenololi 25 mg (50 mg) 1 tableta 1 krát denne.

Tab. Bisoprololi 2,5 mg (5 mg, 10 mg) 1 tableta 1-krát denne.

Tab. Nebivololi 5 mg 1 tableta 1-krát denne.

V prípadoch, keď existujú kontraindikácie na použitie β-blokátorov, je indikované predpisovanie nedihydropyridínových antagonistov vápnika. Jediným antagonistom vápnika, ktorý sa považuje za bezpečný u pacientov s infarktom myokardu, je nisoldipín.

Tab. Nisoldipini 5 mg (10 mg) 1 tableta 2-krát denne.

A je dôležitou súčasťou systému fibrinolýzy. Aktivátor plazminogénu je jedným z enzýmov, ktoré sa najčastejšie podieľajú na procesoch deštrukcie bazálnej membrány, extracelulárnej matrix a bunkovej invázie. Je produkovaný endotelom a je lokalizovaný v cievnej stene [Loscalso, ea 1988]. Tkanivový faktor je fosfolipoproteín. Apoproteín tohto komplexu je integrálny membránový glykoproteín s molekulami. s hmotnosťou asi 46 kDa, ktorá je tesne spojená s fosfolipidmi membrán endotelových buniek, buniek hladkého svalstva a monocytov. TPA sa syntetizuje in vivo ako jednoreťazcový polypeptid (molekulová hmotnosť 72 kDa), ktorý sa premieňa na dvojreťazcovú formu proteolýzou rôznymi proteinázami, vrátane plazmínu, tkanivového kalikreínu a aktivovaného faktora X. Dvojreťazcová forma tPA je aktívnejšia ako jednoreťazcový prekurzor. Optimálne pH pre pôsobenie enzýmu pri premene angiotenzinogénu na Ang II je v kyslej oblasti. Pozri tPA ako enzým tvoriaci ang II. TPA, meraná v krvi, je endoteliálny aktivátor uvoľňovaný do krvného obehu pod vplyvom rôznych stimulov. Koncentrácia tPA v krvi je 6,6+/-2,9 ng/ml.

Tkanivový faktor, transmembránový glykoproteín, je členom rodiny cytokínových receptorov triedy II a môže spôsobiť aktiváciu buniek dvoma mechanizmami.

Tkanivový faktor, iniciátor aktivácie mechanizmu vonkajšej koagulácie krvi, lokalizovaný v bunkách endotelu a hladkého svalstva, sa pri poškodení dostáva do kontaktu s krvou, čo v konečnom dôsledku prispieva k tvorbe trombínu a iniciácii mechanizmu zrážania krvi. Má vysokú afinitu k f.VII cirkulujúcemu v krvi. V prítomnosti Ca++ iónov sa apoproteín T.f. tvorí stechiometrický komplex s f.VII, čo spôsobuje jeho konformačné zmeny a konvertuje ho na serínovú proteinázu f.VIIa štiepením peptidovej väzby Arg-152-Ile. Reakcia je stimulovaná stopovými množstvami proteináz cirkulujúcich v krvi (f.Xa, trombín, f.VIIa, f.IXa). Výsledný komplex (f.VIIa-T.f.) konvertuje f.X na serínovú proteinázu f.Xa. Komplex tkanivový faktor-faktor VII je schopný aktivovať faktor X aj faktor IX, čo v konečnom dôsledku podporuje tvorbu trombínu a [Boyle, E. M., Verrier, E. D., ea., (1996)].

V proteínovej štruktúre T.f. Rozlišujú sa tri domény: hlavná, umiestnená na povrchu bunkovej membrány, transmembránová a cytoplazmatická. Povrchová doména obsahujúca 219 aminokyselinových zvyškov Ser-1-Glu-219 má receptorové funkcie. Za 23-člennou transmembránovou doménou nasleduje cytoplazmatický „chvost“, pomocou ktorého je proteín pripevnený k membráne. Tu sa realizuje schopnosť jediného Cys zvyšku tejto domény tvoriť tioesterovú väzbu s membránovými lipidmi (palmitát alebo stearát). Určitú úlohu zohrávajú alifatické aminokyselinové zvyšky, pomocou ktorých je proteín integrovaný do vnútornej vrstvy membrány, čím sa zvyšuje „ukotvenie“ molekuly tkanivového faktora. Povrchová doména je glykozylovaná na troch treonínových zvyškoch (Thr-13, Thr-126, Thr-139). Obsahuje 4 Cys zvyšky, ktoré tvoria dve disulfidové väzby, jednu v N-konci a druhú v C-koncovej oblasti domény. Tieto väzby stabilizujú zodpovedajúce peptidové slučky. Ukázalo sa, že disulfidová väzba lokalizovaná v C-terminálnej oblasti je funkčne významná, práve jej účasť je nevyhnutná pre prejav kofaktorových funkcií tkanivového faktora vo vzťahu k faktorom VII a VIIa. Na základe analýzy primárnej štruktúry, umiestnenia disulfidových väzieb a štúdia funkčných vlastností bola odhalená jeho homológia s interferónmi Ifn-alfaR a Ifn-gamaR z rodiny cytokínových receptorov II. triedy. V systéme zrážania krvi interakcia faktorov VII/VIIa s receptorom - kofaktorom - tkanivovým faktorom niekoľkotisícnásobne urýchľuje aktiváciu vonkajšieho hemokoagulačného mechanizmu. Toto zrýchlenie sa dosiahne:

Jednak proteolytickým mechanizmom, iniciovaným tvorbou komplexu tkanivového faktora s faktorom VII/VIIa (VII aktívny) zrážania krvi, v ktorom tkanivový faktor funguje ako kofaktor a modulátor faktora VII/VIIa. Väzba faktora VIIa na tkanivový faktor spôsobuje zvýšenie intracelulárnej Ca2+ fosforylácie mitogénom aktivovaných proteínkináz (MAP kináz) - Erk-1, Erk-2, p38, Jnk a vedie k transkripcii génu Egr-1 (skorý rast odpoveď), zvyčajne vyvolaná cytokínmi a rastovými faktormi.

Po druhé, neproteolytickým mechanizmom, v ktorom sa samotná cytoplazmatická doména tkanivového faktora podieľa na intracelulárnej signalizácii, čo vedie k

Vynález sa týka nového zlepšeného tkanivovo aktívneho plazminogénu (vylepšený TPA), ktorý má predĺžený polčas rozpadu v tele a zvýšenú stabilitu voči teplu a kyselinám, ktorý možno použiť na potlačenie zápalu v oblasti trombózy. Vynález sa tiež týka spôsobu výroby uvedeného aktivátora tkanivového plazminogénu pomocou technológie rekombinantnej DNA a prostriedkov použitých na jeho implementáciu. Je známe, že ľudský tkanivový aktivátor plazminogénu (TPA) má priaznivú fibrinolytickú aktivitu a je mimoriadne účinný proti plazminogénu viazanému na fibrín, pričom neaktivuje plazminogén vo fáze voľného obehu v tele tak účinne ako konvenčné trombolytické činidlá, streptokináza (SK ) a urokináza (UK). Aminokyselinová sekvencia ľudského APT a nukleotidová sekvencia cDNA kódujúcej ľudský APT sú známe (Pennica. D. a kol., Nature, 301, 214-221, 1983). Je tiež známe, že ľudský APT rozpúšťa žilové a arteriálne krvné zrazeniny. Veľké klinické štúdie ukazujú, že ľudský APT podávaný intravenózne je účinný pri reperfúzii okludovanej koronárnej artérie u pacienta s akútnym infarktom myokardu. Nevýhodou použitia tohto lieku pri liečbe ochorenia spojeného s tvorbou trombu je však extrémne krátky polčas jeho enzymatickej aktivity v krvi (Rijken, D.C., et al., Thromb. Heamost. 54 (1), 61, 1985, Hubert, E. F. a kol., Blood, 65, 539, 1985). Pri použití na liečbu sa ľudský APT musí podávať ako kontinuálna intravenózna injekcia s vysoká dávka. Je známe, že prirodzene sa vyskytujúci ľudský APT má doménovú štruktúru, počínajúc od N-konca molekuly je tu fingerdoména, EGF doména (epidermálny rastový faktor), dve domény „kringle 1“ a „kringle 2“ a serín proteázový domér. V práci Rijkena a kol. sa uvádza (Rijken D.C. a kol., Thromb. Heamost., 54 (1), 61, 1985), že krátky biologický polčas ľudského APT môže súvisieť so všetkými doménami ľudského APT, okrem serínových doménových proteáz. Práca Zonnevelda a kol. (Zonneveld, A.J.V. a kol., Proc. Natl. Acad. USA., 83, 4670, 1986) tiež poznamenáva, že prstová doména, EFR doména a kringle 2 doména môžu mať dôležité na aktivitu viazania fibrínu prirodzene sa vyskytujúceho ľudského APT, ako aj na udržanie aktivácie APT závislej od fibrínu. Zatiaľ však neboli vyvinuté žiadne špecifické opatrenia na udržanie fibrín-väzbovej aktivity prirodzene sa vyskytujúceho ľudského APT a jeho fibrín-dependentnej aktivity, ako aj na predĺženie biologického polčasu. Publikovaná japonská patentová prihláška č. 48378/1987 opisuje APT získaný deléciou aminokyselín 87-175 prirodzene sa vyskytujúceho ľudského APT, v ktorom je deletovaný "kringle 1". Tento APT sa vyznačuje ďalšou indukovanou bodovou mutáciou v oblasti epidermálneho rastového faktora. Japonská patentová prihláška uvádza, že modifikovaný APT má schopnosť viazať sa na fibrín, ale interakcia s inhibítorom tkanivového aktivátora plazminogénu je oslabená. Európsky patent č. 241208 opisuje APT získaný deléciou aminokyselín 92-179 prirodzene sa vyskytujúceho ľudského APT, v ktorom je tiež deletovaný "kringle 1". Táto práca uvádza, že tento APT má fibrinolytickú aktivitu. Okrem toho európsky patent č. 231624 opisuje modifikovaný APT s predĺženým polčasom rozpadu. Modifikovanému APT, ktorý má sekvenciu F-EGFK2-A, chýba doména kringle 1, ale nie je ukázaný žiadny špecifický spôsob jeho prípravy. Vo svetle vyššie uvedeného je jasné, že modifikovaný APT podľa vynálezu sa musí líšiť od prirodzene sa vyskytujúceho APT v aminokyselinovej sekvencii v oblasti vnútorných domén. V dôsledku rozsiahleho výskumu žiadateľ získal vylepšený APT, ktorý obsahuje prstovú doménu, doménu EFR, doménu kringle 2 a doménu serínovej proteázy, ale prvá doména „kringle 1“ je vymazaná na špecifickom mieste, a do miesta viazania domény bola zavedená mutácia kringle 2 a serínovej proteázy, čo vedie k zlepšenému APT, ktorý vykazuje vynikajúcu odolnosť voči teplu a kyselinám, výrazne predĺžený biologický polčas a významnú protizápalovú aktivitu, pričom si zachováva požadované vlastnosti prirodzene sa vyskytujúce ľudské APT. Vynález sa týka zlepšeného APT. APT podľa vynálezu sa svojou chemickou štruktúrou výrazne líši od prirodzene sa vyskytujúceho ľudského APT a vykazuje vynikajúce vlastnosti. Zlepšený APT v súlade s vynálezom je polypeptid, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu reprezentovanú všeobecný vzorec 28-29, kde R je priama väzba, Y je A-Ile-B (A je Arg alebo Glu a B je lys alebo Ile), výhodne Glu-Jle-Lys. H2N označuje amino koniec a -COOH označuje karboxy koniec). Vo vynáleze sa výraz "vylepšený APT" používa na označenie analógu APT, v ktorom A a B predstavujú aminokyseliny opísané nižšie, v tomto poradí:

Zlepšený APT (II): Arg, Lys;

Advanced APT (V): Arg, Ile;

Advanced APT (VI): Glu, Lys;

Vylepšené APT (VIII): Glu, Ile. Vynález je tiež zameraný na expresiu navrhovaného analógu APT použitím techník rekombinantnej DNA. S tým sú spojené nové DNA kódujúce zlepšené expresné vektory APT a rekombinantnej DNA. Obrázky 1, 2 ukazujú sekvenciu 16 oligodeoxynukleotidov použitých na konštrukciu fragmentu syntetického génu kódujúceho zlepšený APT (II); na obr. 3 - 4 - fragment syntetického génu na konštrukciu vylepšeného APT (II) podľa vynálezu, obsahujúci konce reštrikčných enzýmov Bge 11 a Eco R1, ktorý je skonštruovaný pomocou 16 oligodeoxynukleotidov znázornených na obr. 1 - 2 ; Obrázok 5 - spôsob konštrukcie vylepšeného APT (II) (na obrázku čierna oblasť, tieňovaná oblasť a nešrafovaná oblasť označujú oblasť kódujúcu zrelý proteín APT, oblasť kódujúcu propropeptid a nepreloženú oblasť; Obr. 6 - metóda testovania fragmentu syntetického génového bloku IV stanovením sekvencie DNA báz pomocou dideoxy metódy a metódy 7-DEAZA, Obrázok 7 - metóda konštrukcie expresného vektora pVY1 v živočíšnych bunkách a integrácia DNA vylepšeného APT na pVY1, Obr. 8 - 13 DNA sekvencie kódujúce vylepšený APT (II) a vylepšený APT (V), Obr. APT (V), obr. 20 - reštrikčné enzýmy a funkčná mapa plazmidu pTPA 2, ktorý má fragment Eco R1-Xho (asi 1000 párov báz) prirodzeného génu APT, integrovaný do vektora pBR322 pri štiepení Eco R1 a Bam H1 stránky; Obrázok 21 - mp9 (vylepšený APT (II), ktorý má fragment BgL11-Xho 11 (asi 1500 párov báz) génu, vylepšený APT (II) integrovaný do dvojvláknovej DNA M13 mp9 v mieste štiepenia BamH1; 22 - závislosť "účinku od dávky" pre aktivitu APT zlepšeného APT (VI) a prirodzene sa vyskytujúceho APT pomocou metódy S-2251 v prítomnosti (+Fb) a neprítomnosti (-Fb) fibrínového substituenta, Obr. 23 - zmena aktivity vylepšeného APT (VI) a natívneho APT v krvi králika v priebehu času, Obr. 24 - zmena reziduálnej aktivity vylepšeného APT (VI) po tepelnom spracovaní, Obr. faktor aktivujúci lymfocyty (LAF) zlepšeným APT (VI), Obrázok 26 - aktivácia s použitím denaturovaného proteínu zlepšeného pomocou APT (VI); 27 - degradácia denaturovaného proteínu pod vplyvom zlepšeného APT (VI). Spôsob získania rekombinantnej DNA a transformovaných buniek je podrobne opísaný nižšie. Spôsob získania zlepšeného APT. Gén kódujúci prirodzený APT, z ktorého je odvodený APT podľa predloženého vynálezu, je izolovaný z banky cDNA pripravenej z buniek Bowesovho ľudského melanómu. Poly A+ RNA bola izolovaná z ľudských buniek Bowesovho melanómu a frakcionovaná centrifugáciou v hustotnom gradiente sacharózy. Potom sa vyberie malé množstvo frakcionovanej poly(A) + RNA a frakcia mRNA kódujúca gén APT sa identifikuje bodkovou hybridizáciou s použitím oligonukleotidovej sondy schopnej rozpoznať špecifickú sekvenciu mRNA APT. Použitím tejto frakcie bohatej na APT mRNA ako východiskového materiálu sa pripraví banka cDNA a uskutoční sa skríning pomocou identifikačnej sondy APT mRNA opísanej vyššie. Pretože nebol izolovaný jediný klon, ktorý by mal úplnú sekvenciu génu APT, chýbajúca sekvencia báz sa syntetizuje pomocou syntetizátora DNA, aby sa získal požadovaný gén. Požadovaný gén sa potom skonštruuje indukciou miestne špecifickej mutácie. Fragment Eco R1-Xho 11 sa prirodzene vyskytuje v géne APT (približne 1000 párov báz), ktorého časť je deletovaná na N= konci, zavedená do vektora pBR332 v miestach štiepenia Eco R1 a BamH1, čo vedie k pTPA2. Kmeň (E. coli HB 101/pTPA2) získaný transformáciou E. coli týmto plazmidom bol uložený vo Fermentation Research Institute of Industrial Science and Technology Agency of Japan pod registračným číslom P-9649 (FERM BP-2107). Reštrikčná a funkčná mapa plazmidu pTPA2 je znázornená na obr. Zlepšený gén APT je vložený do plazmidu pVY1. Plazmid pVY1 sa pripravil ligáciou fragmentu BamH1-Kpn1 (približne 2900 párov báz) plazmidu pRSV10 (vyrába Fine Chemicals) s fragmentom zo štiepenia Eco R1 plazmidu pAdD26SV (A) N 3 (N) (získaného od Dr. Hiroshiho Handa z Tokijskej univerzity (po prijatí na oboch tupých koncoch. V súlade s tým tento vektor obsahuje cDNA myšacieho génu dihydrofolátreduktázy pod transkripčnou kontrolou neskorého promótora hlavného adenovírusu (Ad2), skorého promótora SV 40 proti smeru od miesta inzercie vylepšeného génu APT a intrónová a polyadenylačná sekvencia umiestnená po smere génu podľa vynálezu môže byť vložená do iného vhodného expresného vektora. Expresný vektor sa ďalej zavedie do vhodnej hostiteľskej bunky, aby sa získali transformanty. Ako hostiteľské bunky sa môžu použiť prokaryotické bunky, ako napríklad E. coli, Bacillus subtilis atď., eukaryotické mikroorganizmy, ako napríklad kvasinky atď., a bunky vyšších živočíchov. Ako zástupca E. coli sa zvyčajne používa kmeň JM109, kmeň W3110, Q atď. patriaci do kmeňa K12 a kmeň BD170, kmeň BR151 atď. sa používajú ako zástupcovia Bacillus subtilis. Z kvasiniek môžete použiť kmeň RH218, kmeň SHY1 atď. kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Na expresiu sa typicky používa plazmidový vektor alebo fágový vektor, ktorý obsahuje replikón odvodený od druhu kompatibilného s hostiteľskými bunkami a regulačnú sekvenciu. Príkladmi vektora pre E. coli sú napríklad plazmidy pBR322, pUC18, pUC19 atď., fág, napríklad qt, Charon 4A atď., fág M13 atď. pUB110 sa môže použiť ako vektor pre Bacillus subtilis , pSA2100, atď., a YRp7, YEp61, atď. môžu byť použité ako vektor pre kvasinky. Vektor musí niesť promótor schopný exprimovať požadovaný proteín. Ako promótor pre gén E. coli alebo fágový gén možno použiť napríklad Lae, trp, tac, trc, pL atď. Ako hostiteľ sú kultivované živočíšne bunky, ako sú bunky obličiek opice rhesus, bunky lariev komára, obličkové bunky africkej zelenej opice, bunky myších fetálnych fibroblastov, bunky vaječníkov čínskeho škrečka, bunky obličiek ľudského plodu, bunky tkaniva motýľa, bunky podobné ľudskému cervikálnemu epitelu bunky, ľudské myelómové bunky, myšie fibroblasty atď. Ako vektor môžete použiť skorý promótor SV40, neskorý promótor SV40, SV40 nesúci promótor z eukaryotického génu (napríklad gén vtáčieho ovalbumínu indukovateľný estrogénom, gén interferónu, gén tyrozínaminotransferázy indukovateľný glukokortikoidmi, gén tymidínkinázy, skorý gén a neskoré adenovírusové gény, fosfoglycerátkinázový gén, faktorový gén atď.), bovinný papilomavírus alebo vektory z nich odvodené. Okrem toho je známe, že APT vylučované a produkované bunkami majú rôzne N-konce v závislosti od rozdielov v miestach štiepenia. V prípade sekrécie a produkcie APT s použitím kultivačných buniek ako hostiteľa sa metóda štiepenia signálnou peptidázou alebo proteázou líši v závislosti od typu bunky, takže je možné získať druhy APT s rôznymi N-koncami. Tento jav nie je vhodný len pre prípad sekrécie a produkcie s použitím kultivačných buniek, pretože sa predpokladá, že podobný jav môže nastať aj pri získavaní APT cez E. coli, Bacillus sublitis, kvasinky a iné špeciálne modifikované bunky. Na transformáciu hostiteľa s použitím expresného vektora s integrovaným zlepšeným génom APT v prípade E. coli možno použiť metódu Hanahana, Hanahana, D.J.Mol. Biol., 166, 557, 1983), v prípade manipulácie so živočíšnymi bunkami možno použiť metódu fosforečnanu vápenatého (Vander Eb, A. J. a Graham, F. L., Method in Enrymoloqy, 65, 826, 1980, Academic Press) a tak ďalej. Ako je opísané vyššie, vylepšený APT je užitočný na liečbu rôznych získaných ochorení, vrátane vaskulárnej koagulácie (dokonca aj hlboká žila), pľúcna embólia, periférna arteriálnej trombózy embólia spôsobená poškodením srdca alebo periférnych artérií, akútny infarkt myokardu a trombotický záchvat. Podobne ako prirodzene sa vyskytujúci ľudský APT je vylepšený APT obzvlášť vhodný na liečbu akútneho infarktu myokardu. Prirodzene sa vyskytujúci ľudský APT sa nedávno ukázal ako účinný pri rozpúšťaní trombu uzatvárajúceho koronárnu artériu, regenerácii perfúzie myokardu a obnove väčšiny častí v ischemickej myokardiálnej vrstve, keď sa podáva intravenózne v dávke 30 až 70 mg počas 1 až 3 hodín. Zlepšený APT má predĺžený biologický polčas v krvi, a preto je účinný v rovnakých prípadoch ako prirodzene sa vyskytujúci ľudský APT. Očakáva sa, že vylepšený APT môže poskytnúť klinický účinok podobnú prirodzene sa vyskytujúcemu ľudskému APT, v dávke približne 10 % dávky odporúčanej pre prirodzene sa vyskytujúce ľudské APT, a to aj pri jednorazovom podaní. Okrem toho vylepšený APT podľa predloženého vynálezu vykazuje nasledujúce cenné vlastnosti, ktoré boli doteraz neznáme pre natívny ľudský APT a modifikovaný APT. a) Protizápalová aktivita. V mieste trombu sa zisťuje nielen vznik samotného trombu, ale aj tvorba produktov degradácie fibrínu či stopových množstiev kinínu. O týchto látkach je známe, že majú zápalovú aktivitu, a teda spôsobujú zápal v oblasti trombu. Z tohto dôvodu je žiaduce, aby činidlo používané na liečbu trombózy malo nielen trombolytickú aktivitu, ale aj protizápalovú aktivitu. Výsledkom výskumu bolo, že prihlasovateľ bol schopný poskytnúť protizápalovú aktivitu zlepšenému APT na základe dvoch funkcií. Jedným z nich je, že vylepšený APT inhibuje biologickú aktivitu interleukínu 1 (IL-1), ktorý je jedným z mediátorov zápalová reakcia. Predpokladá sa, že IL-1 produkovaný makrofágmi sa podieľa na zápalovej odpovedi prostredníctvom hypertermie, zrýchlenia rastu fibroblastov, produkcie kolagenázy v synoviálnej bunkovej membráne atď., alebo prostredníctvom zrýchlenia syntézy prostacyklínu vo vaskulárnych endotelových bunkách. Je tiež známe, že IL-1 pôsobí na pečeňové bunky, urýchľuje produkciu proteínov (sérový amyloidový proteín, fibrinogén atď.) akútna fáza, ktorá sa zvyšuje so zápalom. Prihlasovateľ zistil, že zlepšený APT inhibuje aktivitu (LAF aktivitu) na zvýšenie mitogénnej reaktivity myšacieho tymocytu, čo je jedna z biologických aktivít IL-1. Ďalšou funkciou je, že pokročilý APT má afinitu k denaturovanému proteínu (denaturovaný imunoglobulín G, denaturovaný albumín atď.), ktorý je výsledkom zápalu v mieste trombu, a ďalej má tú vlastnosť, že je aktivovaný týmto denaturovaným proteínom. Vďaka tejto aktivite vylepšený APT degraduje iba denaturovaný proteín v oblasti zápalu a zápal je možné dočasne zmierniť. Žiadateľ potvrdil gélovou elektroforézou s dodecylsulfátom sodným, že zlepšený APT degraduje iba denaturovaný proteín. Ako je znázornené na obr. 26 je evidentná aktivácia a selektivita zlepšeného APT denaturovaným proteínom. S imunoglobulínom G ošetreným HCI a pri niekoľkonásobne nižších koncentráciách bola preukázaná rovnaká aktivita ako pri fibrinogéne ošetrenom BrCN. Na druhej strane normálny imunoglobulín C nevykazuje aktivačný účinok na zlepšenú APT ani pri koncentrácii 500 μg/ml. Zabránenie opätovnému upchatiu po obnovení perfúzie do okludovanej krvnej cievy. Je známe, že pri liečbe trombózy prirodzenou APT sa po obnovení prietoku krvi do zablokovanej cievy s vysokou frekvenciou pozoruje reoklúzia. Z tohto dôvodu sa kombinovaná terapia uskutočňuje s inhibítorom zrážania krvných doštičiek alebo antikoagulantom. Kombinovaná terapia však spôsobuje interakčné problémy. lieky, kontrola dávok, podobné účinky a pod. Výhodne má samotný APT navyše aktivitu zabraňujúcu reoklúzii. Zlepšený APT podľa tohto vynálezu má schopnosť zabrániť reoklúzii prostredníctvom dvoch typov aktivity. Prvým typom je prevencia rýchleho poklesu koncentrácie APT po zavedení vylepšeného APT v dôsledku predĺženého trvania účinku, čo vedie k eliminácii Stewart-Holmesovho znaku a tým zabraňuje vzniku reoklúzie. Druhým typom je, že zabránením IL-1-indukovanému poškodeniu vaskulárnych endotelových buniek sa nepriamo inhibuje koagulácia krvných doštičiek, čím sa zabráni reoklúzii. c) Zvýšená stabilita. Proteínové prípravky sú väčšinou nestabilné, preto je vhodné prípravky skladovať v mrazenom, suchom stave alebo v nízke teploty vo forme roztoku. Pri podávaní aktivátora plazminogénu pacientovi s akútnym infarktom myokardu je potrebné vykonať zákrok do niekoľkých hodín po nástupe záchvatu, aby sa znížila úmrtnosť. V tomto prípade sú žiaduce stabilné prípravky, ktoré možno skladovať pri izbovej teplote. okrem toho zvýšená stabilita umožňuje tepelnú úpravu, úpravu kyselinou atď. pri príprave liekov. Najmä s ohľadom na vylepšený APT podľa predkladaného vynálezu, ktorý je produkovaný bunkovými kultúrami, je možné odstrániť retrovírus pochádzajúci z buniek, o ktorom je známe, že je citlivý na teplo. Vynález je ďalej opísaný konkrétnejšie s odkazom na príklady, ale nie je na ne obmedzený. Pokiaľ nie je uvedené inak, rekombinantná DNA sa vyrába podľa laboratórnych pokynov. Maniatis T a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manuál, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York (1982). Príklad 1. Klonovanie do APT DNA. Bunky Bowesovho ľudského melanómu (zakúpené od Dr. Roblina, R., National Cancer Research Institute, USA) boli kultivované podľa metódy Opdenakker et al. (Opdenakker, G., a kol., Eur. J. Biochem, 131, 481-487 (1983)). Na indukciu APT mRNA sa do kultivačnej zmesi pridal TPA (12-0-tetradekanoylforbol-13-acetát) v konečnej koncentrácii 100 ng/ml, po čom nasledovala kultivácia počas 16 hodín. Celková bunková RNA sa potom extrahovala z kultivovaných buniek podľa modifikovanej metódy Freemana et al. ((Okayama)Berqa DNA Manual, str. 3, 1985, Pharmacy Fine Chemicals). Pomocou oligo-dT celulózovej kolóny (vyrobenej Pharmacia Fine Chemicals) sa poly(A) + RNA oddelí od celkovej bunkovej RNA. Výsledkom je, že z približne 10 o buniek sa získa asi 400 μg poly(A) + RNA. Táto poly(A)+ RNA sa frakcionuje konvenčným spôsobom centrifugáciou v hustotnom gradiente sacharózy. Vyberie sa časť frakcionovanej poly(A) + RNA a uskutoční sa dot blot hybridizácia (Perbal, B., Apractical Gube to Molecular Cloninq, 410, 1984, John Wiley and Sons, Inc.) s použitím oligonukleotidovej sondy špecifickej pre APT mRNA. . Tu použitá sonda (sonda Y) má sekvenciu báz 5"-GCNNGGCAAAGATGGCA-3", ktorá je komplementárna k oblasti mRNA kódujúcej aminokyselinové zvyšky +291 až +297 v sekvencii APT opísanej Pennicaetalom a je syntetizovaná spoločnosťou -kyanofosfamidátová metóda s použitím syntetizátora DNA, model 380A, (vyrába Applied Biosystems). Syntéza DNA oligoméru, deprotekcia, štiepenie živice a purifikácia sa uskutočňujú v súlade s návodom na použitie syntetizátora DNA, Model 380A. Rádioaktívne značenie Y sondy na 5" konci sa uskutočňuje v súlade s laboratórnym manuálom s použitím T4 polynukleotidkinázy (vyrába Taka-Ra Shuzo Co., Ltd.) a -(32P) ATP. Sonda Y silne hybridizuje, hlavne s 20-30S poly(A) + RNA (táto frakcia sa nazýva M frakcia). Pomocou templátu sa získa 10 ug poly(A) + RNA z frakcie M; 3 μg dvojvláknovej cDNA sa syntetizovali pomocou reverznej transkriptázy (vyrába Biochemical Industry Co., Ltd.) podľa Gubler-Hoffmanovej metódy (Gubler, U. a Hoffman, B.J., Gene 25, 263, 1983) a pridali sa k dvojvláknovej cDNA na 3"-koncovom deoxy C-vlákne podľa Denq-Wu metódy (Denq, G. R. a Wu, R., Nucleic Acids Res., 9, 4173, 1981). Dvojvláknová cDNA predĺžila deoxy C reťazcom sa potom podrobí gélovej filtrácii na Sepharose CL 4B (vyrába Fine Chemicals Pharmacy), aby sa odstránili nukleové kyseliny s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktoré majú menej ako 500 párov báz. cDNA sa potom žíha s pBR322 (vyrába Bethesda Research) obsahujúci deoxy G-vlákno v mieste Pst 1 pomocou tradičných techník Zmes získaná po žíhaní sa transformuje do kompetentných buniek HB101 E. coli (vyrobené spoločnosťou Takara Shuzo Co., Ltd.), výsledkom čoho je banka cDNA pozostávajúca z približne 4000 nezávislých Táto cDNA sa podrobí hybridizácii kolónií s použitím sondy Y opísanej vyššie v súlade s Woodsovou metódou (Woods, D., Focus, 6 (3), 1, 1984, vyrobené Bethesda Research Lab.), čím sa získajú klony, ktoré interagujú so sondou Y. Medzi klonmi je identifikovaný klon pTPA1 obsahujúci najdlhšiu cDNA APT. Potom sa uskutoční dideoxy metóda (Carlson, J. a kol., J. Biotechnoloqy, 1, 253, 1984), s použitím fágového vektora M13 a metódy 7-DEAZA (Mizusawa S., a kol., Nucleis Acids Res., 14, 1319, 1986). Ako výsledok sa zistilo, že plazmid pTPA1 obsahuje sekvenciu báz od Ty+441 do Ay+2544 pre APT gén opísaný Pennicaetalom. Príklad 2. Návrh vylepšeného APT (II). V plazmide pTPA1 ukázanom v príklade 1 je N-koncová oblasť nedostatočná na konštrukciu vylepšeného APT (II), ktorému chýba doména kringle 1. Preto sa deficientný segment DNA syntetizuje tak, ako je opísané vyššie, s použitím syntetizátora DNA 380A (vyrába Applied Biosystems). Sekvencia báz syntetizovaného oligoméru a úplná syntetizovaná sekvencia sú znázornené na obr. 1-4. Špecifické techniky na konštrukciu zlepšeného APT (II) s použitím týchto oligomérov sú znázornené na obr. 5-6. 2-1). Konštrukcia bloku IV (fragment Bql II-Eco R1, asi 480 párov báz). Fragment bloku IV na obr. 5 sa získa nasledovne. Po prvé, podľa laboratórnej príručky, 40 pmol každého zo syntetických oligonukleotidov 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 a 15 znázornených na obr. 1-2 sa fosforylovali s 10 jednotkami T4 polynukleotidkinázy (vyrába Takara Shuzo Co., Ltd.) pri 37 °C počas jednej hodiny v 50 ul reakčného roztoku pre každú z nich. Na reakčný roztok sa pôsobí fenolom. Po vyzrážaní etanolom sa zrazeniny vysušia pri zníženom tlaku a rozpustia v sterilnej destilovanej vode. Po usadení 40 pmol každého oligoméru v 150 μl roztoku obsahujúceho 6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM NaCl, 7 mM MgCl2 a 0,1 mM EDTA pri teplote 80 °C počas 5 minút pri teplote 60 o C počas 5 minút a pri izbovej teplote počas jednej hodiny, v zodpovedajúcich blokoch bloku I (oligoméry 1, 2, 3 a 4), bloku II (oligoméry 5, 6, 7, 8, 9 a 10) a bloku III (oligoméry 11, 12, 13, 14, 15 a 16) uskutočňujú zrážanie etanolom a sušenie pri zníženom tlaku. Zvyšok sa rozpustí v 40 ul sterilnej destilovanej vody. Reakcia sa uskutočnila v 400 ul reakčného roztoku pri 4 °C počas 15 hodín s použitím súpravy na ligáciu DNA (vyrába Takara Shuzo Co., Ltd.). Po vyzrážaní etanolom a vysušení pri zníženom tlaku sa zrazenina rozpustí v sterilnej destilovanej vode: v prípade bloku I (1) sa gélová elektroforéza uskutočňuje v 5 % polyakrylamide (laboratórna príručka), separuje sa a čistí sa tradičným spôsobom (laboratórna príručka), fragment asi 100 párov báz a v prípade bloku II (2) a bloku III (3) sa gélová elektroforéza uskutočňuje v 3 % agarózovom géli (LMP agaróza, výrobca BRL) (laboratórna príručka ) a fragmenty asi 190 párov sa izolujú a purifikujú elektroelúciou (laboratórna príručka). Potom sa pomocou vyššie uvedenej súpravy na ligáciu DNA ligovalo 0,1 ug, 0,2 ug a 0,2 ug fragmentov bloku I, bloku II a bloku III. Gélová elektroforéza sa uskutočňuje pri koncentrácii agarózy 1,5 %, aby sa izoloval fragment Bgl II-Eco Rl (blok IV) s veľkosťou približne 480 párov báz. DNA sa potom izoluje z agarózového gélu pomocou elektroelúcie. Táto DNA sa potom fosforyluje v 100 ul reakčného roztoku pri 37 °C počas jednej hodiny s použitím 10 jednotiek vyššie uvedenej T4 polynukleotidkinázy, potom sa spracuje s fenolom, vyzráža sa etanolom a suší sa pri zníženom tlaku. Tento syntetický génový fragment a bloková IV bázová sekvencia sú potvrdené stanovením bázovej sekvencie dideoxy metódou s použitím M13 fágového vektora. Špecifické techniky sú znázornené na obr. 6. Po ligácii vyššie opísaného Bgl II-Eco Rl fragmentu bloku IV s M13 mp18 DNA (vyrába Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) štiepenou reštrikčnými enzýmami BamH1 (vyrába Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd. .) a Eco R1 (vyrobené spoločnosťou Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) určia svoju základnú sekvenciu pomocou sekvenčnej súpravy M13 (vyrába Taraka Shuzo K., Ltd.) a sekvenčnej súpravy 7-DEAZA (vyrába Takara Shuzo Spol., s.r.o.). Miesto štiepenia reštrikčným enzýmom Bgl1 a miesto štiepenia reštrikčným enzýmom BamH1 sú ligované v izoschizomerickom usporiadaní cez (miesto štiepenia konca BamH1-Bgl11) a ligovaný fragment môže byť štiepený reštrikčným enzýmom Xho 11, čo vedie k prirodzenému Bgl. 11 a štiepne konce Bamh1. Na presnejšie určenie sekvencie báz sa kmeň E.cjli JM109 infikuje fágom M 13mp18 (vrátane fragmentu bloku IV) v súlade s metódou Messing/Messing J., Methods in Enzymology, 101, 20-78 (1983). )), po ktorej sa získa dvojvláknová DNA (replikatívny typ). Po štiepení tejto DNA (50 μg) reštrikčnými enzýmami Xho 11 (vyrába Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co) a Eco R1 sa uskutočnila gélová elektroforéza na 1,5 % agarózovom géli, aby sa izoloval fragment (blok IV) s veľkosťou približne 480 báz. párov. Táto DNA sa extrahuje elektroelúciou. Po ligácii extrahovanej DNA s DNA M13mp19 (vyrába Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd) štiepenou reštrikčnými enzýmami EcoRl a BamHl rovnakým spôsobom, ako je opísané vyššie, sa pomocou súpravy na ligáciu DNA určila sekvencia báz. Ako je opísané vyššie, túto sekvenciu možno presnejšie overiť sekvenovaním oboch DNA pomocou M13mP18 a M13mp19. Okrem toho sa opísaným spôsobom pripravila dvojvláknová replikatívna DNA M13mp19 (s blokom IV). Po štiepení tejto DNA (50 ug) reštrikčnými enzýmami Eco Rl a Xho 11 sa uskutoční gélová elektroforéza v 1,5 % agaróze, pričom sa izoluje fragment (blok IV) s veľkosťou približne 480 párov báz. 2-2). Izolácia bloku V (fragment Eco R1-Bal1, približne 1250 párov báz). Z klonu pTRA1 získaného v príklade 1 sa izolovala plazmidová DNA vo veľkých množstvách podľa metódy opísanej v laboratórnej príručke, ako je znázornené na obr. 5. Po štiepení 70 μg tejto DNA reštrikčnými enzýmami Bal1 (vyrába Takara Shuzo Co. , Ltd.) a Nar1 (vyrába Nirro Gene Co., Ltd.) uskutočňujú elektroforézu v 0,8 % agarózovom géli, pričom sa izoluje fragment Nar1-Bal1 (približne 1540 párov báz). DNA sa izoluje elektroelúciou. Po ďalšom čiastočnom štiepení tejto DNA reštrikčným enzýmom EcoRl sa uskutoční elektroforéza na 0,7% agarózovom géli, pričom sa izoluje fragment EcoRl-Bal1 (asi 1250 párov báz). DNA sa izoluje elektroelúciou. 2-3). Konštrukcia vylepšeného génu APT (II) z bloku IV a bloku V. Ako je znázornené na obr. 5, zlepšený gén APT sa získa nasledovne. Po dopingu bloku IV (fragment Bgl11-Eco R1, približne 480 bp) získaného v príklade 2-1 blokom V (fragment Eco R1-Bal1, približne 1250 bp) získaným v príklade 2-2 s použitím súpravy na doping DNA opísanej vyššie, dopovaný produkt sa podrobí zrážaniu etanolom. Po vysušení pri zníženom tlaku sa zrazenina bežným spôsobom štiepi reštrikčným enzýmom Xho 11. Potom sa uskutoční elektroforéza v 0,8 % agarózovom géli, aby sa izoloval fragment Bgl 11-Xho 11 (asi 1500 párov báz, obsahuje gén pre zlepšený APT). DNA sa potom izoluje elektroelúciou. Kompletná sekvencia báz vylepšeného génu APT (II) získaná týmto spôsobom je znázornená na obr. 8-13. Odvodená aminokyselinová sekvencia je tiež znázornená na obr. 14-19. Príklad 3. Konštrukcia génu pre zlepšené APT V, VI a VIII. Konštrukcia vylepšeného génu APT V, VI alebo VIII sa uskutočňuje na základe vylepšeného génu APT (II) s odkazom na nasledujúce publikácie. Genetická konverzia sa uskutočňuje indukciou miestne špecifickej mutácie. Publikácie: Zoller M. J. a Smith. M., Method in Fermentology, 100, str. 468-500 (1983), Zoller M. J. a Smith. M. DNA, 3, str. 479-488 (1984), Morinaga Y. a kol., Biotechnology, str. 636-630 (júl 1984), Adelman J. P. a kol., DNA, 2, str. ), 6. M13 Sequencing Manual (puC) publikovaný Gene Science Room Co., Ltd.). 3-1). Konštrukcia vylepšeného génu APT (V). A) Vytvorenie M13mp19 (APT/P/) na mutáciu. Vylepšený fragment génu APT (II), podrobne opísaný v príklade 2, 2-3, sa ligoval do dvojvláknovej DNA M13mp9 ošetrenej reštrikčným enzýmom BamH1 a alkalickou fosfatázou (vyrába Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligačný produkt sa transfekoval do kompetentných buniek E. cjli JM109 (vyrába Takara Shuzo Co. , Ltd). Každý klon, ktorý vytvorí bezfarebnú, sterilnú škvrnu, sa použije na infekciu E. coli JM109. Jednovláknová DNA sa izoluje zo supernatantu kultúry a dvojvláknová (replikatívna) DNA sa izoluje z buniek E. cli podľa Messingovej metódy (J. Messing, Methods in Enzymology, 101, str. 20-78, 1983 ). Analýzou povahy týchto dvojvláknových DNA sa po štiepení reštrikčným enzýmom Pst1 elektroforézou na agarózovom géli získa klon mp9 (vylepšený APT(II)), v ktorom je gén APT(II) vložený do mp9 DNA v požadovanom smere, ako je znázornené na obr. 21. Po odštiepení časti týchto DNA reštrikčným enzýmom Pst sa uskutoční elektroforéza na 0,8 % agarózovom géli, kde klon mp9 (vylepšený APT (II) vykazuje jednoduchý pás na pozíciách 7300 bp, približne 840 bp, 430 bp a 80 bp Jednovláknová DNA tohto klonu sa použije v nasledujúcom experimente na vyvolanie miestne špecifickej mutácie.B) Syntéza priméru schopného vyvolať miestne špecifickú mutáciu. Syntetický oligonukleotid použitý na vyvolanie miestne špecifickej mutácie v vylepšenom géne APT (II) sa syntetizuje metódou -kyanoetylfosfoamidátu s použitím syntetizátora DNA, model 380 A (vyrába Applied Biosystems). Syntéza oligoméru DNA, odstránenie ochrannej skupiny, odštiepenie od živice a čistenie sa uskutočňujú v súlade s návodom na obsluhu syntetizátora DNA 380 A. Na vyvolanie mutácie na špecifickom mieste sa použije primér (1) schopný indukujúcu miestne špecifickú mutáciu a primér (2) na dideoxy sekvenovanie s použitím fágového vektora M13 (J. Carlson a kol., Journal of Biotechnology, 1, str. 253, 1984). Sú uvedené aminokyselinové a nukleotidové sekvencie pre vylepšený APT (II). Primér (1), schopný vyvolať mutáciu, sa odlišuje podčiarknutou bázou od génovej sekvencie vylepšeného APT (II) (pozri tabuľku 1). C) Vyvolanie miestne špecifickej mutácie. Nižšie je uvedený spôsob vytvorenia klonu obsahujúceho sekvenciu báz priméru (1) schopného produkovať mutáciu, konkrétne vylepšený gén APT (IV). Po anelácii (renaturácii) jednovláknovej DNA opísanej v príklade 3.3-1, A) klonu mp9 (vylepšený APT (II) a primer (1), sa produkt renaturácie prevedie na dvojvláknovú DNA, ktorá sa potom transformuje na E. coli JM 109. Potom sa pomocou sekvenačného priméru skrínujú sekvencie DNA, pričom sa izoluje fágový klon nesúci mutovaný zlepšený gén APT (II), konkrétne vylepšený gén APT (V). Z tohto klonu sa extrahuje dvojvláknová (replikatívna) fágová DNA a izoluje sa vylepšený gén APT (V). 5"-koncová fosforylácia syntetického oligoméru. DNA primer (1) na vyvolanie miestne špecifickej mutácie sa fosforyluje metódou opísanou v príklade 2.2-1. Príprava heteroduplexu DHE. 0,5 μg jednovláknovej DNA M13mp9 (vylepšené APT (II)) a 1,5 μg dvojvláknovej DNA M13mp9, štiepenej reštrikčným enzýmom BamH1, sa zahrieva v 30 μg roztoku obsahujúcom 2 pmol fosforylovaného priméru (1) 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA a 50 mM NaCl, pri teplote 90 o C (2 min), 50 o C (5 min), 37 o C (5 min) a pri izbovej teplote (10 min). 36 μl roztoku 50 mM K roztoku sa pridá Tris-HCl (pH 8,0), ktorý obsahuje 4 jednotky Klenowovho enzýmu, 7 jednotiek T4 fágovej DNA ligázy, 0,1 mM EDTA, 12 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 0,7 mM ATP, 0,07 dATP a mM každého z dGTP, dTTP a dCTP, aby sa stimulovalo predĺženie priméru. Zmes sa nechá reagovať pri 20 °C počas 2 hodín a pri 4 °C počas 15 hodín. Transformácia sa uskutoční použitím vyššie opísaného roztoku a kompetentných E. coli bunky JM109 (vyrobené spoločnosťou Takara Shuzo Co., Ltd.), kým sa nevytvoria lytické škvrny. Po oddelení bezfarebnej škvrny sa fág infikuje E. coli JN109 na proliferáciu. Templátová jednovláknová DNA sa potom získa zo supernatantu kultúry pre každý klon. Tieto jednovláknové DNA sa podrobia iba „T“ reakcii (reakcia „A“ a „T“ v príklade 3-2) dideoxy metódy s použitím sekvenčného priméru (2), po ktorej nasleduje elektroforéza na polyakrylamidovom géli. Po vysušení sa gél analyzuje autorádiografiou. Na základe výsledkov sa identifikuje klon s požadovanou mutantnou sekvenciou. Kultivačný supernatant klonu sa použije na infekciu buniek E. coli JM109 a znovu sa naočkuje na platňu, aby sa izolovala jediná škvrna. Z výslednej jedinej škvrny sa izoluje jednovláknová DNA podľa vyššie uvedeného spôsobu. Pomocou týchto DNA sa najprv určí sekvencia báz DNA dideoxy metódou s použitím sekvenčného priméru (2), čím sa získa klon zmutovaný na požadovanú sekvenciu báz. Po infekcii tohto fágového klonu bunkami JM-109 E. coli použitím Messingovej metódy opísanej v príklade 2 sa získa dvojvláknová DNA. Táto dvojvláknová DNA sa štiepi reštrikčným enzýmom Xho 11, uskutoční sa elektroforéza v 0,8 % agarózovom géli, aby sa izoloval fragment (vylepšený gén APT (V) s veľkosťou približne 1500 párov báz, obsahujúci vylepšený gén APT. DNA sa potom extrahuje elektroelúciou. Okrem toho sa úplná sekvencia báz takto získanej DNA určí dideoxy metódou, pričom sa zistí, že DNA je vylepšený APT (V) gén. Kompletná sekvencia báz takto získaného vylepšeného génu APT (V) (ale obsahujúca signálny peptid -35 až -1) je znázornená na obr. 11 - 13. Odvodená aminokyselinová sekvencia je tiež znázornená na obr. 17 - 19. 3-2) Návrh vylepšeného APT (VI) a (VIII). Techniky sú podobné tým, ktoré sú opísané v príklade 3, 3-1). Najprv sa skonštruuje M13mp3 (vylepšený APT (II)) a potom sa syntetizujú priméry na vyvolanie miestne špecifickej mutácie. Sekvencia báz týchto primérov je však opísaná vyššie, aby sa skonštruoval zlepšený gén APT (VI) a zlepšený gén APT (VIII), fosforylovaný primér s 5" koncom (3) a fosforylovaný primér s 5" koncom (5 ) (pozri tabuľku .2). Po indukcii miestne špecifickej mutácie sa kompletná sekvencia báz určí dideoxy metódou. Potvrdilo sa, že majú požadované sekvencie báz. Tak sa získajú gény pre zlepšený APT (VI) a zlepšený APT (VIII). Tieto gény sa potom integrujú do vektora pVY1 v súlade s postupom opísaným v príkladoch 4 a 5. Príklad 4. Integrácia vylepšeného génu APT (II) do vektora pVY1. 4-1) Konštrukcia vektora pVY1. Vektor pVY1 sa pripraví tak, ako je znázornené na obr. 7. A) Konštrukcia pAdD26SV (A) N3 (N) a tupé ukončenie štiepneho miesta Eco Rl. Najprv sa DNA pAdD26SV(A) N3 (zakúpená od Dr. Hiroshi Handa na Tokijskej univerzite, známa z abstraktov v Mo1, Ce 11. Biol, 2 (11, (1982)) štiepi reštrikčným enzýmom Bgl11 (vyrobený od Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) tradičným spôsobom DNA sa potom otupí tradičným spôsobom pomocou Klenowovho enzýmu (vyrába Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) Po spracovaní fenolom, vyzrážaní etanolom a sušením pri zníženom tlaku sa zrazeniny rozpustia v sterilnej destilovanej vode.Po ďalšej ligácii sa kompetentné bunky HB101 E. coli (vyrába Takra Shuzo Co. Ltd.) transformujú reakčnou zmesou Plazmidové DNA sa pripravia z transformantov vykazujúcich tetracyklínovej rezistencie obvyklým spôsobom Po odštiepení časti týchto DNA reštrikčným enzýmom BgL 1 sa uskutoční elektroforéza na 0,7 % agaróze. Výsledkom je klon nesúci DNA, ktorá nie je štiepená reštrikčným enzýmom BgL 11. Po štiepení (pAdD26SV(A) N3 (N)) DNA tohto klonu reštrikčným enzýmom Eco R1 tradičným spôsobom je DNA urobené tupým použitím Klenowovho enzýmu, ako je opísané vyššie. Po spracovaní fenolom, vyzrážaní etanolom a vysušení pri zníženom tlaku sa zrazeniny rozpustia v destilovanej sterilnej vode. B) Izolácia fragmentu Kpn 1-BamHl (asi 2900 bp) z pKSV10 a vytvorenie tupých koncov. Potom, čo sa pKSV10 DNA (vyrobené Fine Chemicals) štiepi reštrikčnými enzýmami Kpn1 a BamH1 tradičným spôsobom, DNA sa zatupia pomocou T4 DNA polymerázy (laboratórna príručka, str. 114 - 121). Potom sa uskutoční elektroforéza v 0,7% agarózovom géli, aby sa izoloval fragment s veľkosťou približne 2900 párov báz. Fragment sa potom elektroeluuje, aby sa extrahovala DNA

C) Konštrukcia pVY1. Po ligácii DNA fragmentu získaného v A) a DNA fragmentu získaného v B) sa uskutoční transformácia kompetentných buniek E. coli HB101 (opísané vyššie). Plazmidová DNA sa získa z transformantov vykazujúcich rezistenciu voči tetracyklínu pomocou tradičnej metódy. Potom, čo sa časť týchto plazmidových DNA štiepila reštrikčným enzýmom Pst1 (vyrába Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd), sa uskutočnila elektroforéza na 1,0 % agarózovom géli. Výsledkom je klon (plazmid pVY1) charakterizovaný pásmi s asi 3400 pármi báz, asi 3200 pármi báz a asi 1400 pármi báz. Tento E/coli klon HB101 (pVY1 bol uložený vo Fermentation Research Institute of Industrial Science and Technology Agency of Japan pod registračným číslom P-9625 (FEPM BP 2106). 4-2) Integrácia vylepšeného génu APT (II ) do vektora pVY1. Po odštiepení DNA plazmidu pVY1 získaného v príklade 4-1) reštrikčným enzýmom BgL 11 tradičným spôsobom sa defosforylácia uskutoční použitím alkalický fosfát (vyrába Takara Shuzo. Co. Ltd.). Potom sa ošetrenie fenolom uskutoční trikrát. A po vyzrážaní etanolom a vysušení pri zníženom tlaku sa zrazeniny rozpustia v sterilnej destilovanej vode. Po ligácii tejto DNA s BgL fragmentom 11-Xho 11 (približne 1500 párov báz) získaným v príkladoch 3, 3-1) a HB101 kompetentné bunky E. coli boli transformované produktom ligácie v súlade s metódou opísanou vyššie. Plazmidová DNA sa pripravuje z transformantov rezistentných na tetracyklín tradičným spôsobom. Po štiepení týchto DNA reštrikčnými enzýmami (BqL 11, Pst 1) sa vyberie klon so zlepšeným génom APT (II) vo vektore pVY1 integrovaný v požadovanom smere a selekcia sa uskutoční na základe analýzy vzor elektroforézy na agarózovom géli. Najprv sa časť týchto DNA štiepi reštrikčným enzýmom BqL 11, nasleduje elektroforéza na 0,8 % agarózovom géli, čím sa získa klon s pásom fragmentu s veľkosťou približne 1500 bp, keď sa fragment BqL 11-Xho 11 liguje do BqL. fragment 11 plazmidov pVY1, ligovaná časť Xho 11 a BqL 11 sa môže odrezať reštrikčným enzýmom BqL 11. Časť plazmidovej DNA týchto klonov sa ďalej štiepi reštrikčným enzýmom Pst1 a DNA sa podrobí elektroforéze v 0,8% agarózovom géli, aby sa získal klon, ktorý má jeden pás s veľkosťou približne 3400 bp, dva pásy približne 2300 bp, jeden pás približne 1400 bp a jeden pás približne 80 bp. Pomocou tohto klonu (plazmid pVY1-APT (II) v súlade s laboratórnym manuálom sa získa plazmidová DNA. Príklad 5. Integrácia génov zlepšeného APT (V), (VI) a (VIII) do vektora pVY1. Po štiepení DNA plazmidu pVY1 získaného v príklade 4-1) sa defosforylácia reštrikčného enzýmu BqL 11 uskutočnila bežným spôsobom s použitím alkalickej fosfatázy (vyrába Takara Shuzo Co., Ltd.), po čom nasledovalo ošetrenie (3-krát) fenol, vyzrážanie etanolom a sušenie pri zníženom tlaku. Potom sa sediment rozpustí v sterilnej destilovanej vode. Po ligácii tejto DNA s fragmentom BqLII-Xho 11 s veľkosťou približne 1500 párov báz získaným v príkladoch 2, 2-3) sa ligačný produkt transformuje do vyššie uvedených kompetentných buniek HB101 E. coli. Plazmidové DNA sa pripravia z transformantov vykazujúcich rezistenciu na tetracyklín konvenčným spôsobom. Po štiepení týchto DNA reštrikčnými enzýmami BqL11 a Pstl sa uskutoční elektroforéza na agarózovom géli. Analýzou separačného vzoru v agarózovom géli sa vyberú klony, v ktorých je zlepšený APT (V) gén vložený do pVYI vektora v požadovanom smere. Najprv sa po štiepení niektorých z týchto DNA reštrikčným enzýmom BqL11 uskutoční elektroforéza na 0,8 % agarózovom géli, aby sa získali klony a získal sa pás s približne 1500 pármi báz. Keď je fragment BqL11-Xholl spojený s fragmentom BqL11 vektora pVYI, časť Xholl a BqL11 môže byť odštiepená reštrikčným enzýmom BqL11 v dôsledku vyššie uvedenej konfigurácie izoschizoméru. Po ďalšom štiepení časti plazmovej DNA týchto klonov reštrikčným enzýmom Pstl sa uskutoční elektroforéza pri koncentrácii agarózového gélu 0,8 %, čím sa získa klon poskytujúci pás približne 3400 bp, pás približne 2300 bp, dva pásy s približne 1400 bp, jeden pás s približne 800 bp a jeden pás s približne 80 bp. Pomocou klonu (plazmid pVYI-APT (V)) sa získa plazmidová DNA vo veľkých množstvách na základe laboratórnej príručky. Podobne sú gény pre zlepšené APT (VI) a (VIII) integrované do vektora pVYI. Príklad 6 Expresia pokročilého APT v CHO bunkách. Plazmid pVYI - vylepšený APT (VI), APT (II), APT (V) alebo APT (VIII) sa transfekuje do DHFR-deficientných CHO buniek (Urlaub a kol., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 77 (7), 4216-4224, 1980) metódou fosforečnanu vápenatého (Graham a kol., Viroloqy, 52, 456, 1973). Zistilo sa, že klon transformantov získaný na selektívnom médiu (MEM A LPHA (-), GIBCO) v prítomnosti metotrexátu (MTX) vykazuje aktivitu APT 50 až 100 jednotiek/ml (hodnota stanovená opísanou metódou fibrín/agaróza nižšie). Tento klon sa použije na následné štúdie. Použité produkčné médium je GIT médium (vyrába Huaco Pure Chemical Industry Co., Ltd.) doplnené 20 medzinárodnými jednotkami/ml (SIGMA) aprotinínu. Príklad 7. Purifikácia zlepšeného APT zo supernatantu kultúry CHO buniek. Kultivačný supernatant získaný v príklade 6 bol čiastočne purifikovaný s použitím anti-APT monoklonálnej protilátkovej afinitnej kolóny. Tradičným spôsobom sa pripraví hybrid produkujúci monoklonálne protilátky pre APT pochádzajúci z ľudských melanómových buniek. Hybrid produkujúci protilátku sa naočkuje myšiam a monoklonálna protilátka (podtrieda: IgGM1) vyvinutá v ascite sa extrahuje a čistí pomocou Cellulophin Protein A (vyrába Biochemical Industry Co. , Ltd) a tlmivý systém MAPS na čistenie monoklonálnych protilátok vyrobený spoločnosťou Biorad Laboratories. Protilátka sa tradičným spôsobom spojí s CN3r-aktivovanou Sepharosou (vyrába Pharmacia Fine Chemicals) rýchlosťou 4 mg na 1 ml gélu. Protilátkový gél (24 ml) sa zmieša so štyrmi litrami kultivačného supernatantu. Po miernom pretrepávaní cez noc pri 4 °C sa gél vloží do kolóny (priemer 1,5 cm x 20 cm). Gél sa potom postupne premyje 125 ml každého z nasledujúcich roztokov (1) Tris-HCl pufor pH 7,4 (pufor A) obsahujúci 25 medzinárodných jednotiek/ml aprotinínu (vyrába SIGMA) a 0,01 % (w/v) Tween 80 (2) pufor A obsahujúci 0,5 M NaCl, (3) pufor A obsahujúci 4 M močovinu a (4) pufor A. Pokročilý gél-viazaný APT bol eluovaný 0,2 M glycín-HCl pufrom pH 2. 5 obsahujúcim 25 medzinárodných jednotiek/ml aprotinínu a 0,01 % (w/v) Tween 80. Aktívne frakcie sa zredukujú a spoja. Po dialýze proti 10 mM Tris-HCl pufru, pH 7,4, ktorý obsahuje 25 medzinárodných jednotiek/ml aprotinínu a 0,01 % (w/v) Tween 80 cez noc, sa dialyzát skoncentruje 20-30 krát pomocou vákuového odstredivého koncentrátu (Speed ​​VAC, vyrobený spoločnosťou SAVANT Inc.). Koncentrát sa znova cez noc dialyzoval proti 10 mM Tris-HCl pufru, pH 7,4, ktorý obsahuje 0,15 M NaCl, 25 medzinárodných jednotiek/ml aprotinínu a 0,01 % (hmotn./obj.) Tween 80 a použil sa na následné hodnotenia in vitro a in vivo. . Nakoniec sa špecifická aktivita zvýši 3700-5000 krát a výťažok je od 36 do 42 % aktivity APT (stanovené metódou fibrín/agaróza). Táto aktívna frakcia sa analyzuje elektroforézou s dodecylsulfátom sodným a farbením striebrom. Za redukčných podmienok sa pozoruje veľmi silný pás pri 54 kilodaltonoch spolu s niekoľkými ďalšími pásmi. Na elektroforézny gél sa potom pôsobí 2,5 % (hmotn./obj.) Triton X-100 a umiestni sa na fibrín/agarózovú platňu, aby sa zaznamenal fibrín pri 37 °C, pričom rozpustený pás sa detegoval pri asi 50 kilodaltonoch. Na tej istej platni sa prirodzený APT objavuje pri asi 60 kilodaltonoch. Výsledky naznačujú, že APT adsorbovaný na protilátkovú afinitnú kolónu a eluovaný týmto spôsobom zodpovedá zlepšenému APT s molekulovou hmotnosťou, ktorá je približne o 10 000 nižšia ako molekulová hmotnosť prirodzene sa vyskytujúceho typu. Príklad 8. Meranie špecifickej aktivity zlepšeného APT. Množstvo proteínu v čiastočne purifikovanom pokročilom APT sa stanoví meraním celkového proteínu podľa BradFordovej metódy (Bradford, Anal. Bochem., 72, 248 (1976)), s použitím hovädzieho sérového albumínu ako referenčného proteínu. Meria sa množstvo antigénu APT enzýmový imunotest(ELISA). Fibrinolytická aktivita bola stanovená metódou fibrín/agaróza a metódou rozpúšťania 125 1-značeného fibrínového filmu. Fibrín/agarózová platňa sa pripraví pridaním agaru do 95 % koagulovaného fibrinogénu. Spôsob rozpúšťania 1-značeného fibrínového filmu 125 sa uskutočňuje podľa opisu Hoyraeertsa a kol. (J. Biol. Chem. 257, 2912, 1982), s použitím ako štandardu APT z ľudských melanómových buniek vyrobených Bioscott Inc. a štandardizované v súlade s medzinárodným štandardom APT (Gaffuey a Curtis, Thromb. Haemostas, 53, 34, 1985). Hodnota špecifickej aktivity, vypočítaná z hodnoty aktivity stanovenej metódou rozpúšťania 125 1-fibrínového filmu a množstva antigénu stanoveného enzýmovou imunoanalýzou (ELISA), bola v rozsahu od 300 000 do 420 000 jednotiek/mg antigénu. Príklad 9. Afinita zlepšeného APT k fibrínu a aktivácia fibrínom

V súlade s prácou Verheijen a kol./EMBOJ, 5, 3525, 1986) bola študovaná afinita zlepšeného APT k fibrínu. Zlepšený alebo prirodzene sa vyskytujúci APT (1000 jednotiek/ml) sa pridá k fibrinogénu v rôznych koncentráciách, po čom nasleduje pridanie jednej jednotky trombónu, po čom nasleduje reakcia pri teplote miestnosti počas 3 minút. Výsledná fibrínová zrazenina sa vyzráža centrifugáciou pri 16 000 ot./min. počas 8 minút a množstvo APT, ktoré nie je naviazané na fibrín, sa stanoví meraním aktivity metódou fibrín/agaróza. Výsledkom bolo zistenie, že zlepšený APT (VI) vykazuje rovnakú afinitu k fibrínu ako prirodzená forma. Aby sa preskúmal stupeň aktivácie plazminogénu zlepšeným APT v prítomnosti alebo neprítomnosti fibrínu, uskutočnil sa nasledujúci experiment. Pomocou titračnej platne sa prirodzene sa vyskytujúci alebo zosilnený APT pridá k 0,1 M Tris-HCl pufru, pH 7,5, ktorý obsahuje 0,3 mM syntetický substrát p-niroanilid tripeptid S-2251 (H-D-Val-leulys-pNA HCl, vyrobený Kabi Inc. ), 0,13 μM plazminogénu bez plazmínu, 120 μg/ml DESAFIB TM (vyrába American Diagnostics Inc.) a 0,1 % Tween 80, aby sa získal celkový objem 200 μl. Systém sa udržiava pri 37 °C. Po určitom čase sa meria absorbancia (optická hustota) pri vlnovej dĺžke 405 nm pomocou Titertech Multiscan 310 Model. Krivka dávka-odozva pre amidolytickú aktivitu zlepšeného APT (VI) a prirodzene sa vyskytujúceho APT je znázornená na obr. 22. Posun krivky dávka-odozva v dôsledku pridania DESAFIB TM pre prirodzene sa vyskytujúce APT zodpovedá hodnote 158-násobku, zatiaľ čo pri vylepšenom APT dosahuje 100-násobok. Je to spôsobené tým, že aktivita vylepšeného APT (VI) v neprítomnosti lieku DESAFIB TM je nižšia, približne 1/20, ako aktivita prirodzeného APT. Príklad 10. Analýza zlepšeného APT na fibrinolytickú aktivitu v krvnom obehu králika. Farmakinetika porovnaním aktivity prirodzene sa vyskytujúceho APT (n-APT) a zlepšeného APT podľa predkladaného vynálezu u králikov. Ako je možné vidieť na obr. 23, vylepšený APT ukazuje zreteľné predĺženie biologického polčasu existencie v aktívnom stave (prirodzený APT vykazuje polčas 1-2 minúty, zatiaľ čo vylepšený APT je biologicky aktívny 8-15 minút). Okrem toho je evidentné, že hodnota aktivity 5% (hodnota 30 sekúnd po podaní je 100%) stále zostáva v zlepšenom APT aj 60 minút po jeho podaní (prirodzený APT vykazuje aktivitu rovnajúcu sa 0,1 po 60 minútach) , % pôvodnej). Tento experiment sa uskutočňuje nasledovne

Na testovanie je vybraný japonský biely králik s hmotnosťou 2,4 kg. V pentobarbitalovej anestézii sa APT podáva cez periférnu ušnú žilu. Dávka je 15 400 jednotiek (0,8 ml) zlepšeného APT na králika a 5 400 jednotiek (0,8 ml) n-APT na králika (hodnoty stanovené metódou fibrínovej platne). Potom sa odoberie 2,5 ml krvi stehenná tepna pomocou katétra v rôznych časových intervaloch (od 0,5 do 60 minút) a pridal sa do 1/9 objemu citrátu sodného (3,8 %). Do 30 minút po odbere krvi sa vykoná centrifugácia pri nízkej rýchlosti, čím sa oddelí plazma. Pomocou separovanej plazmy sa meria aktivita APT v krvi. (1) Meranie aktivity APT. Po 16-násobnom zriedení 0,2 ml plazmy 3 mM ľadovou kyselinou octovou sa zriedený produkt odstredí pri nízkej rýchlosti rotácie, čím sa získajú precipitáty. Precipitáty sa rozpustia v 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, so 140 mM NaCl v objeme ekvivalentnom objemu plazmy, čím sa získa euglobulínová frakcia. Aktivita APT sa stanoví pridaním tejto euglobulínovej frakcie na fibrín/agarózovú misku. Po inkubácii platne pri 37 °C počas 16 hodín sa aktivita APT pozorovala ako plak. Štandardná krivka pre metódu fibrín/agaróza sa pripraví zriedením APT použitého na podanie zvieraťu na 0,1 až 10 000 jednotiek/ml. Aktivita APT v krvi stanovená týmto spôsobom sa vyjadrí v percentách, pričom sa použije aktivita APT získaná odberom krvi 30 s po podaní, pričom sa berie ako 100 %. Príklad 11. Stabilita zlepšeného APT (VI) voči teplu a kyselinám. Na stanovenie tepelnej odolnosti sa vylepšený APT (VI) a prírodný APT zriedili 50 mM Tris pufrom obsahujúcim 100 mM NaCI a 0,01 % Tween 80, pH 7,4, na koncentráciu 100 ug/ml, v danom poradí. Každý roztok sa uchováva vo vriacej vode (teplota 98 ​​°C) 2-60 minút. Po ochladení sa stanoví zvyšková aktivita metódou fibrínovej platne. Ako je znázornené na obr. 24, pokles aktivity zlepšeného APT (VI) je nevýznamný v porovnaní s poklesom aktivity prirodzeného APT. Napríklad po tepelnom spracovaní počas 2 minút sa aktivita prirodzeného APT zníži na 25 %, zatiaľ čo vylepšený APT (VI) si stále zachováva aktivitu na 71 %. Na štúdium odolnosti voči kyselinám sa vylepšený APT (VI) a prírodný APT rozpustia v 0,5 N. HCl s koncentráciou 100 μg/ml, po čom nasleduje usadenie pri teplote miestnosti počas 30 minút. Po neutralizácii sa aktivita stanoví metódou fibrínovej platne. Zlepšený APT nevykazuje žiadnu zmenu aktivity, zatiaľ čo aktivita prirodzeného APT je znížená o 50 %. Príklad 12 Inhibícia aktívneho faktora stimulujúceho lymfocyty zlepšeným APT (VI)

Zlepšené APT (VI) a prirodzené APT boli vhodne nariedené v médiu tkanivovej kultúry PPM1 1640 obsahujúcom 7 % fetálneho teľacieho séra a 58 uM 2-merkaptoetanolu. 100 ul riedenia sa nanesie do 96-jamkovej doštičky na kultiváciu tkaniva, potom sa pridá 50 ul bunkovej suspenzie obsahujúcej tymocyty (2107 buniek/ml) zo samcov myší C3H/He J vo veku 4 až 6 týždňov, konkanavalín A (1,2 μg/ml), ako aj 50 μl IL-1 (4 jednotky/ml, Aenzyme Inc), nasledovala kultivácia počas 48 hodín v inkubátore pri 37 °C s obsahom 5 % oxidu uhličitého. Potom sa pridá H3-tymidín v koncentrácii 0,5 μ. kocka palec /20 ul/jamka. Po kultivácii počas 18 hodín sa bunky zhromaždia na filtri zo sklenených vlákien a množstvo3H-tymidínu zavedeného do buniek sa meria kvapalinovým scintilačným počítačom, aby sa určila aktivita faktora stimulujúceho lymfocyty. Ako je znázornené na obr. 25, prirodzený APT neinhibuje aktivitu faktora stimulujúceho lymfocyty, ale zlepšený APT ju výrazne potláča. Pri testovaní so samotným rozpúšťadlom sa nepozoroval žiadny účinok. Príklad 13 Protizápalová aktivita založená na denaturovanom proteíne. 1) Získanie denaturovaného proteínu. Po inkubácii proteínového roztoku (5 mg/ml) v 0,1 N. roztokom HCl alebo 0,1 N. roztoku NaOH pri teplote 37 o C počas 2-3 hodín, roztok proteínu sa neutralizuje rovnakým množstvom NaOH alebo HCl. 2) Afinita vylepšeného APT (VI) k denaturovanému proteínu. Spôsob: Podľa postupu uvedeného nižšie sa denaturovaný proteín „prilepí“ na nitrocelulózový film. Potom sa meria množstvo vylepšeného APT spojeného s ošetrením proteínom a nitrocelulózovým filmom, čím sa hodnotí afinita vylepšeného APT k denaturovanému proteínu. Kúsok nitrocelulózového filmu sa ponorí do 20 mM Tris-HCl tlmivého roztoku, pH 7,5, obsahujúceho 140 mM NaCI. Sušenie. Denaturovaný proteín (50 μg/10 μl) sa po kvapkách uvoľní na kúsok nitrocelulózového filmu. Sušenie. Blokovanie 3% roztokom želatíny. Splachovanie. Kúsok nitrocelulózovej fólie sa ponorí do roztoku vylepšeného APT /1 μg/ml/. Splachovanie. Pridá sa plazminogén a syntetický substrát S-2251 a nasleduje inkubácia pri 37 °C (kvantitatívna analýza absorbovaného pokročilého APT). Meranie absorbancie pri 405 nm. Výsledky: Ako je uvedené v tabuľke 3, zlepšený APT vykazoval afinitu k imunoglobulínu G ošetrenému HCl, albumínu ošetrenému HCl a albumínu ošetrenému NaOH. Na druhej strane, zlepšený APT nevykazuje afinitu k intaktnému imunoglobulínu G a albumínu. 3) Aktivácia zlepšeného APT (VI) denaturovaným proteínom. Metóda: do reakčného roztoku vylepšeného aktivátora APT (denaturovaný proteín, BrCN - spracovaný fibrinogén atď.) sa pridá plazminogén (0,0078 jednotiek v 10 μl), 100 μl 3 mM syntetického substrátu S-2251 a rôzne množstvá pufra TBS. pri rôznych koncentráciách, čím sa získa 0,275 ml reakčného roztoku. K reakčnému roztoku sa pridá Advanced APT (2,5 n/g v 25 ul) na spustenie reakcie. Po určitej dobe reakcie sa k reakčnému roztoku pridá 2% dodecylsulfát sodný (ekvimolárne množstvo), aby sa reakcia zastavila. Meraním optickej hustoty (OD 405) sa určí aktivita vylepšeného APT. Výsledky: Ako je znázornené na obr. 26, albumín ošetrený NaOH a imunoglobulín G ošetrený HCl vykazovali silný aktivačný účinok zlepšeného APT. Najmä u imunoglobulínu G ošetreného HCl je aktivácia silná a aktivita imunoglobulínu G ošetreného HCl je približne rovnaká ako aktivita fibrinogénu ošetreného BrCN a v koncentrácii, ktorá je niekoľkonásobne nižšia. Intaktný albumín a imunoglobulín G nevykazujú aktiváciu. 4) Degradácia denaturovaného proteínu pod vplyvom zlepšeného APT (VI). Metóda: Po zreagovaní denaturovaného proteínu so vylepšeným APT za rovnakých podmienok ako v metóde opísanej v predchádzajúcom pododseku, okrem toho, že syntetický substrát S - 2251 sa nepridáva do reakčného systému a množstvo denaturovaného proteínu je 133 μg/ ml sa uskutoční elektroforéza v polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným v prítomnosti -merkaptoetanolu. Výsledky: Ako je znázornené na obr. 27, proteín denaturovaný úpravou NaOH alebo úpravou HCL má za následok vymiznutie pásov ef-proteínu zo vzoru a tvorbu degradačných produktov, čo naznačuje jeho rozklad. Na druhej strane, pri použití intaktného albumínu sa po interakcii so zlepšeným APT nezistila žiadna zmena v ef-vzorci, a preto sa nezistila žiadna degradácia denaturovaného proteínu.

NÁROK

1. Rekombinantný tkanivový aktivátor plazminogénu s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou na str. kde Y je Glu-Ile-Lys;

H2N - amino koniec;

COOH - karboxy koniec;

R - priama väzba alebo podobná sekvencia obsahujúca substitúcie a/alebo delécie a/alebo inzercie nesúvisiace so zmenami aktivity,

A s nasledujúcimi vlastnosťami: fibrinolytická aktivita, stanovená metódou rozpúšťania 1 2 5 I-fibrínového filmu, schopnosť aktivácie fibrínom a aktivita zlepšeného tpA v neprítomnosti fibrínu, ktorá je nižšia ako aktivita prirodzený tpA, zvýšený polčas v porovnaní s prírodnou formou, zvýšený v porovnaní s prírodným tpA odolnosť voči kyselinám a teplu, schopnosť inhibovať faktor aktivujúci lymfocyty a schopnosť aktivácie denaturovaným proteínom. 2. Spôsob výroby rekombinantného tkanivového aktivátora plazminogénu, zahŕňajúci kultiváciu hostiteľských buniek transformovaných rekombinantnou DNA obsahujúcou sekvenciu kódujúcu analóg tpA a následnú purifikáciu cieľového produktu, vyznačujúci sa tým, že hostiteľské bunky sú kultivované transformované rekombinantným vektorom obsahujúcim DNA sekvencia kódujúca tpA klauzulu 1.