Aglutinačná reakcia (RA). Podrobná aglutinačná reakcia (RA). Približná aglutinačná reakcia (RA). Priame hemaglutinačné reakcie Rozlišujte medzi priamymi a nepriamymi aglutinačnými reakciami

Č. 29 Aglutinačná reakcia. Komponenty, mechanizmus, spôsoby inštalácie. Aplikácia.
Aglutinačná reakcia- jednoduchá reakcia, pri ktorej protilátky viažu korpuskulárne antigény (baktérie, erytrocyty alebo iné bunky, nerozpustné častice s adsorbovanými antigénmi, ako aj makromolekulové agregáty). Vyskytuje sa v prítomnosti elektrolytov, napríklad keď sa pridá izotonický roztok chloridu sodného.
Používajú sa rôzne varianty aglutinačnej reakcie: extenzívna, indikatívna, nepriama atď. Aglutinačná reakcia sa prejavuje tvorbou vločiek alebo sedimentu (bunky „zlepené“ protilátkami s dvomi alebo viacerými centrami viažucimi antigén - obr. 13.1). RA sa používa na:
1) stanovenie protilátok v krvnom sére pacientov, napríklad s brucelózou (Wrightova, Heddelsonova reakcia), týfusom a paratýfusom (Vidalova reakcia) a inými infekčnými chorobami;
2) určenie patogénu izolovaný od pacienta;
3) stanovenie krvných skupín pomocou monoklonálnych protilátok proti aloantigénom erytrocytov.
Na stanovenie protilátok u pacienta vykonajte podrobnú aglutinačnú reakciu: Diagnosticum (suspenzia usmrtených mikróbov) sa pridá k riedeniam pacientovho krvného séra a po niekoľkých hodinách inkubácie pri 37 °C sa zaznamená najvyššie riedenie séra (sérový titer), pri ktorom došlo k aglutinácii, t. j. zrazenine. tvorené.
Povaha a rýchlosť aglutinácie závisí od typu antigénu a protilátok. Príkladom sú zvláštnosti interakcie diagnostika (O- a H-antigénov) so špecifickými protilátkami. Aglutinačná reakcia s O-diagnosticum (baktérie usmrtené teplom, zadržiavajúce termostabilný O-antigén) prebieha vo forme jemnozrnnej aglutinácie. Aglutinačná reakcia s H-diagnosticum (baktérie usmrtené formaldehydom, zadržiavajúce termolabilný bičíkový H-antigén) je hrubá a prebieha rýchlejšie. Ak je potrebné určiť patogén izolovaný od pacienta, dajte indikatívna aglutinačná reakcia, pomocou diagnostických protilátok (aglutinačné sérum), t.j. vykonáva sa sérotypizácia patogénu. Indikatívna reakcia sa uskutočňuje na podložnom sklíčku. Čistá kultúra patogénu izolovaná od pacienta sa pridá do kvapky diagnostického aglutinačného séra v riedení 1:10 alebo 1:20. V blízkosti je umiestnená kontrola: namiesto séra sa aplikuje kvapka roztoku chloridu sodného. Keď sa v kvapke so sérom a mikróbmi objaví vločkovitý sediment, vykoná sa podrobná aglutinačná reakcia v skúmavkách so zvyšujúcimi sa riedeniami aglutinačného séra, do ktorej sa pridajú 2-3 kvapky suspenzie patogénu. Aglutinácia sa berie do úvahy podľa množstva sedimentu a stupňa čírosti kvapaliny. Reakcia sa považuje za pozitívnu, ak sa aglutinácia pozoruje v zriedení blízkom titru diagnostického séra. Súčasne sa berú do úvahy kontroly: sérum zriedené izotonickým roztokom chloridu sodného by malo byť priehľadné, suspenzia mikróbov v tom istom roztoku by mala byť rovnomerne zakalená, bez sedimentu.
Rôzne príbuzné baktérie môžu byť aglutinované rovnakým diagnostickým aglutinačným sérom, ktoré
sťažuje ich identifikáciu. Preto používajú adsorbované aglutinačné séra, z ktorých
krížovo reagujúce protilátky adsorpciou na príbuzné baktérie. Protilátky sú v takýchto sérach zachované,
špecifické len pre danú baktériu.

1.1. AGLUTINAČNÁ REAKCIA (RA)

AGLUTINAČNÁ REAKCIA (RA)

Vďaka svojej špecifickosti, jednoduchosti výkonu a demonštratívnosti sa aglutinačná reakcia rozšírila v mikrobiologickej praxi na diagnostiku mnohých infekčné choroby.

Aglutinačná reakcia je založená na špecifickosti interakcie protilátok (aglutinínov) s celými mikrobiálnymi alebo inými bunkami (aglutinogény). V dôsledku tejto interakcie vznikajú častice a aglomeráty, ktoré sa zrážajú (aglutinujú) vo forme vločiek.

Aglutinačná reakcia môže zahŕňať živé aj usmrtené baktérie, spirochéty, huby, prvoky, rickettsie, ako aj červené krvinky a iné bunky. Reakcia prebieha v dvoch fázach: prvá (neviditeľná) špecifická, kombinácia antigénu a protilátok, druhá (viditeľná) nešpecifická, zlepenie antigénov, t.j. tvorba aglutinátu.

Aglutinát vzniká, keď sa jedno aktívne centrum divalentnej protilátky spojí s determinantnou skupinou antigénu. Aglutinačná reakcia, ako každá sérologická reakcia, prebieha v prítomnosti elektrolytov.

Navonok má prejav pozitívnej aglutinačnej reakcie dvojaký charakter. V bičíkovitých mikróboch, ktoré majú iba somatický antigén O2, sa samotné mikrobiálne bunky priamo zlepia. Táto aglutinácia sa nazýva jemnozrnná. Vyskytuje sa do 18 22 hodín. v

Bičíkaté mikróby majú dva antigény: somatický O2 antigén a bičíkový H2 antigén. Ak sú bunky zlepené bičíkmi, vytvárajú sa veľké, voľné vločky a táto aglutinačná reakcia sa nazýva hrubozrnná. Vyskytuje sa do 2 4 hodín.

Aglutinačná reakcia sa môže uskutočniť ako za účelom kvalitatívneho, tak aj kvantifikáciašpecifických protilátok v krvnom sére pacienta a na určenie druhu izolovaného patogénu. v

Aglutinačná reakcia sa môže vykonávať ako v rozšírenej verzii, ktorá umožňuje pracovať so sérom nariedeným na diagnostický titer, tak aj vo verzii indikatívnej reakcie, ktorá v zásade umožňuje detegovať špecifické protilátky alebo určiť druh patogén.

Pri vykonávaní podrobnej aglutinačnej reakcie sa na zistenie špecifických protilátok v krvnom sére subjektu odoberá testovacie sérum v riedení 1:50 alebo 1:100. Je to spôsobené tým, že normálne protilátky môžu byť prítomné vo veľmi vysokých koncentráciách v celom alebo mierne zriedenom sére a potom môžu byť výsledky reakcie nepresné. Materiál, ktorý sa testuje v tejto verzii reakcie, je krv pacienta.

Krv sa odoberá nalačno alebo najskôr 6 hodín po jedle (inak môžu byť v krvnom sére kvapôčky tuku, takže je zakalené a nevhodné na výskum). Krvné sérum pacienta sa zvyčajne odoberá v druhom týždni ochorenia sterilným odberom 3 × 4 ml krvi z kubitálnej žily (do tejto doby sa koncentruje maximálne množstvo špecifických protilátok). Ako známy antigén sa používa diagnostické činidlo pripravené z usmrtených, ale nezničených mikrobiálnych buniek špecifického druhu so špecifickou antigénnou štruktúrou.

Pri vykonávaní podrobnej aglutinačnej reakcie na určenie druhu a typu patogénu je antigén živý patogén izolovaný zo študovaného materiálu. Protilátky obsiahnuté v imunodiagnostickom sére sú známe. v

Imunitné diagnostické sérum sa získava z krvi očkovaného králika. Po určení titra (maximálne riedenie, pri ktorom sa detegujú protilátky) sa diagnostické sérum naleje do ampuliek s prídavkom konzervačnej látky. Toto sérum sa používa na identifikáciu podľa antigénnej štruktúry izolovaného patogénu.

MOŽNOSTI AGLUTINAČNEJ REAKCIE

Tieto reakcie zahŕňajú antigény vo forme častíc (mikrobiálnych buniek, červených krviniek a iných korpuskulárnych antigénov), ktoré sú navzájom zlepené protilátkami a precipitujú.

Na uskutočnenie aglutinačnej reakcie (RA) sú potrebné tri zložky: 1) antigén (aglutinogén); 2) protilátka (aglutinín) a 3) elektrolyt (izotonický roztok chloridu sodného).

ORIENTATÍVNA (TAŠŤOVÁ) AGLUTINAČNÁ REAKCIA (RA)

Indikatívna alebo doštička RA sa umiestni na sklíčko pri teplote miestnosti. Na tento účel použite Pasteurovu pipetu na samostatné nanesenie kvapky séra v zriedení 1:10 1:20 a kontrolnej kvapky izotonického roztoku chloridu sodného na sklo. Kolónie alebo denná kultúra baktérií (kvapka diagnostica) sa zavedú do oboch bakteriologických slučiek a dôkladne sa premiešajú. Reakcie sa vizuálne zohľadnia po niekoľkých minútach, niekedy pomocou lupy (x5). Pri pozitívnej RA je zaznamenaný výskyt veľkých a malých vločiek v kvapke séra, pri negatívnom zostáva sérum rovnomerne zakalené.

NEPRIAMA (PASÍVNA) HEMAGLUTINÁČNÁ REAKCIA (RNGA, RPGA)

Reakcia sa vykonáva: 1) na detekciu polysacharidov, proteínov, extraktov baktérií a iných vysoko disperzných látok, rickettsie a vírusov, ktorých komplexy s aglutinínmi nie je možné pozorovať pri konvenčných RA, alebo 2) na detekciu protilátok v sére pacientov proti tieto vysoko disperzné látky a najmenšie mikroorganizmy.

Nepriama alebo pasívna aglutinácia sa chápe ako reakcia, pri ktorej protilátky interagujú s antigénmi vopred adsorbovanými na inertných časticiach (latex, celulóza, polystyrén, oxid bárnatý a pod. alebo ovčie červené krvinky, ľudská krvná skupina I(0)).

Pri pasívnej hemaglutinačnej reakcii (RPHA) sa ako nosič využívajú červené krvinky. Antigénom nabité červené krvinky sa zlepia v prítomnosti špecifických protilátok proti tomuto antigénu a vyzrážajú sa. Antigénom senzibilizované erytrocyty sa v RPGA používajú ako erytrocytové diagnostické zariadenie na detekciu protilátok (sérodiagnostika). Ak sú červené krvinky nabité protilátkami (erytrocytové protilátky diagnosticum), môže sa použiť na detekciu antigénov.

Inscenácia. V jamkách polystyrénových platní sa pripraví séria sériových riedení séra. Do predposlednej jamky pridajte 0,5 ml zjavne pozitívneho séra a do poslednej jamky 0,5 ml fyziologického roztoku (kontroly). Potom pridajte 0,1 ml zriedeného erytrocytárneho diagnosticum do všetkých jamiek, pretrepte a vložte do termostatu na 2 hodiny.

účtovníctvo. V pozitívnom prípade sa červené krvinky usadzujú na dne otvoru vo forme rovnomernej vrstvy buniek so zloženým alebo zúbkovaným okrajom (obrátený dáždnik), v negatívnom prípade sa usadzujú vo forme gombíka alebo krúžku. .

1.2. NEUTRALIZAČNÁ REAKCIA. LYSIS,
OPSONOFAGOCYTICKÁ REAKCIA, REAKCIA PRECENITEĽNOSTI

REAKCIA NEUTRALIZÁCIE EXOTOXÍNU ANTITOXÍNOM (RN)

Reakcia je založená na schopnosti antitoxického séra neutralizovať účinok exotoxínu. Používa sa na titráciu antitoxických sér a stanovenie exotoxínu.

Pri titrácii séra sa k rôznym riedeniam antitoxického séra pridá určitá dávka zodpovedajúceho toxínu. Keď je antigén úplne neutralizovaný a neexistujú žiadne nespotrebované protilátky, dochádza k počiatočnej flokulácii. Vločkovacia reakcia sa môže použiť nielen na titráciu séra (napríklad záškrtu), ale aj na titráciu toxínu a toxoidu. Reakcia neutralizácie toxínu s antitoxínom má veľkú praktický význam ako metóda na stanovenie aktivity antitoxických terapeutických sér. Antigén v tejto reakcii je skutočný exotoxín.

Sila antitoxického séra je určená konvenčnými jednotkami AE.

1 AE botulotoxínu jeho množstvo neutralizuje 1000 DLM botulotoxínu. Neutralizačná reakcia na určenie druhu alebo typu exotoxínu (na diagnostiku tetanu, botulizmu, záškrtu atď.) sa môže uskutočniť in vitro (podľa Ramona) a pri stanovení toxigenity mikrobiálnych buniek - v géli ( podľa Ouchterlonyho).

Lytická reakcia (RL)

Jednou z ochranných vlastností imunitného séra je jeho schopnosť rozpúšťať mikróby alebo bunkové elementy vstupujúce do tela.

Špecifické protilátky, ktoré spôsobujú rozpustenie buniek (lýzu), sa nazývajú lyzíny. V závislosti od povahy antigénu to môžu byť bakteriolyzíny, cytolyzíny, spirochetolyzíny, hemolyzíny atď.

Lyzíny prejavujú svoj účinok iba v prítomnosti dodatočného komplementového faktora. Komplement, ako faktor nešpecifickej humorálnej imunity, sa nachádza takmer vo všetkých telesných tekutinách, okrem cerebrospinálnej tekutiny a tekutina prednej komory oka. V ľudskom krvnom sére bol zaznamenaný pomerne vysoký a konštantný obsah komplementu a v krvnom sére je ho veľa morské prasa. U iných cicavcov je obsah komplementu v krvnom sére odlišný.

Doplnok je komplexný systém srvátkových bielkovín. Je nestabilný a zrúti sa pri 55 stupňoch na 30 minút. Pri izbovej teplote sa komplement zničí do dvoch hodín. Veľmi citlivý na dlhodobé trasenie, kyseliny a ultrafialové lúče. Komplement sa však dlhodobo (až šesť mesiacov) skladuje v sušenom stave pri nízkych teplotách. Doplnok podporuje lýzu mikrobiálnych buniek a červených krviniek.

Rozlišujú sa reakcie bakteriolýzy a hemolýzy.

Podstatou bakteriolýznej reakcie je, že keď sa špecifické imunitné sérum spojí so zodpovedajúcimi homológnymi živými mikrobiálnymi bunkami v prítomnosti komplementu, dôjde k mikrobiálnej lýze.

Reakcia hemolýzy spočíva v tom, že keď sú erytrocyty vystavené špecifickému séru, ktoré je voči nim imúnne (hemolytické) v prítomnosti komplementu, pozoruje sa rozpúšťanie erytrocytov, t.j. hemolýza.

Hemolytická reakcia v laboratórnej praxi sa používa na stanovenie rozsahu komplementu, ako aj na zohľadnenie výsledkov diagnostických reakcií fixácie komplementu. Titer komplementu je jeho najmenšie množstvo, ktoré spôsobí lýzu červených krviniek do 30 minút v hemolytickom systéme v objeme 2,5 ml. K lýznej reakcii, podobne ako pri všetkých sérologických reakciách, dochádza v prítomnosti elektrolytu.

REAKCIE PRECENITEĽNOSTI (ALERGICKÉ)

Určité formy antigénu môžu pri opakovanom kontakte s telom spôsobiť reakciu, ktorá je špecifická vo svojom základe, ale zahŕňa nešpecifické bunkové a molekulárne faktory akútnej zápalovej reakcie. Sú známe dve formy precitlivenosti: precitlivenosť okamžitého typu (IHT) a precitlivenosť oneskoreného typu (DTH). Prvý typ reakcie nastáva za účasti protilátok a reakcia sa vyvíja najneskôr do 2 hodín po opakovanom kontakte s alergénom. Druhý typ sa realizuje pomocou zápalových T buniek (Tgc) ako hlavných efektorov reakcie, ktoré zabezpečujú akumuláciu makrofágov v oblasti zápalu; reakcia sa prejavuje po 6-8 hodinách a neskôr.

Vzniku hypersenzitívnej reakcie predchádza stretnutie s antigénom a vznik senzibilizácie, t.j. objavenie sa protilátok, aktívne senzibilizovaných lymfocytov a pasívne senzibilizovaných cytofilných protilátok iných leukocytov (makrofágy, granulocyty).

Hypersenzitívne reakcie majú tri fázy vývoja: imunologické; patochemické; patofyziologické.

V prvej, špecifickej fáze alergén interaguje s protilátkami a (alebo) senzibilizovanými bunkami. V druhej fáze sa z aktivovaných buniek uvoľňujú biologicky aktívne látky. Uvoľnené mediátory (histamín, serotonín, leukotriény, bradykinín atď.) spôsobujú rôzne periférne účinky charakteristické pre príslušný typ reakcie tretej fázy.

Reakcie precitlivenosťštvrtý typ

Reakcie tohto typu sú spôsobené patogénnymi medzibunkovými interakciami senzibilizovaných pomocných T-buniek, cytotoxických T-lymfocytov (T-killer cells) a aktivovaných buniek mononukleárneho fagocytového systému, spôsobených dlhotrvajúcou stimuláciou imunitného systému bakteriálnymi antigénmi, v ktorých je prítomný tzv. relatívna nedostatočnosť imunitného systému organizmu eliminovať bakteriálne patogény z vnútorného prostredia infekčné ochorenia. Tieto reakcie z precitlivenosti spôsobujú u pacientov s tuberkulózou tuberkulózne pľúcne dutiny, ich kazeóznu nekrózu a celkovú intoxikáciu. Kožná granulomatóza pri tuberkulóze a lepre z morfopatogenetického hľadiska je z veľkej časti zložená z reakcií precitlivenosti štvrtého typu.

Najznámejším príkladom štvrtého typu hypersenzitívnej reakcie je Mantouxova reakcia, ktorá sa vyvíja v mieste intradermálnej injekcie tuberkulínu pacientovi, ktorého telo a systém sú senzibilizované na mykobakteriálne antigény. V dôsledku reakcie sa vytvorí hustá hyperemická papula s nekrózou v strede, ktorá sa objaví len niekoľko hodín (pomaly) po intradermálnej injekcii tuberkulínu. Tvorba papule začína výstupom z cievne lôžko do medzibunkových priestorov mononukleárnych fagocytov cirkulujúcej krvi. Súčasne začína emigrácia polymorfonukleárnych buniek z cievneho riečiska. Potom infiltrácia neutrofilmi ustúpi a infiltrát sa začne skladať prevažne z lymfocytov a mononukleárnych fagocytov. Tým sa líši od Mantouxovej reakcie od Arthusovej reakcie, pri ktorej sa v mieste lézie hromadia prevažne polymorfonukleárne leukocyty.

Pri hypersenzitívnych reakciách typu 4 vedie dlhodobá stimulácia senzibilizovaných lymfocytov antigénmi k patologické zmeny tkanív k patologicky intenzívnemu a predĺženému uvoľňovaniu cytokínov pomocnými T bunkami. Intenzívne uvoľňovanie cytokínov v miestach poškodenia tkaniva spôsobuje hyperaktiváciu buniek systému mononukleárnych fagocytov, ktoré sa tam nachádzajú, z ktorých mnohé v hyperaktivovanom stave tvoria vlákna epiteloidných buniek a niektoré sa navzájom spájajú a vytvárajú obrovské bunky. Makrofágy, na povrchu ktorých sú vystavené bakteriálne a vírusové antigény, môžu byť zničené fungovaním Tkillerov (prirodzených zabíjačov).

Štvrtý typ hypersenzitívnej reakcie je vyvolaný rozpoznaním cudzieho bakteriálneho antigénu pomocnými T bunkami, ktoré sú naň senzibilizované. Nevyhnutnou podmienkou rozpoznania je interakcia induktorov s antigénmi exponovanými na povrchu buniek prezentujúcich antigén po endocytóze a spracovaní cudzích imunogénov mononukleárnymi fagocytmi. Ďalší nevyhnutná podmienka expozície antigénov v kombinácii s molekulami I. triedy z hlavného histokompatibilného komplexu. Po rozpoznaní antigénu senzibilizované pomocné bunky uvoľňujú cytokíny a najmä interleukín2, ktorý aktivuje prirodzené zabíjačské bunky a mononukleárne fagocyty. Aktivované mononukleárne fagocyty uvoľňujú proteolytické enzýmy a voľné kyslíkové radikály, ktoré poškodzujú tkanivo.

Kožné alergické testy sú testy na určenie senzibilizácie tela na alergény, určenie jeho infekcie, napríklad tuberkulózy, brucelózy, úrovne kolektívnej imunity, napríklad na tularémiu. Podľa miesta podania alergénu sa rozlišujú: 1) kožné testy; 2) skarifikácia; 3) intradermálne; 4) subkutánne. Klinická reakcia na alergén počas testu na kožnú alergiu je rozdelená na lokálnu, všeobecnú a fokálnu, ako aj okamžitú a oneskorenú.

Miestne reakcie mediátor typu GNT sa objaví po 520 minútach, prejaví sa vo forme erytému a pľuzgiere, zmizne po niekoľkých hodinách, hodnotí sa plusovou metódou podľa veľkosti erytému, meranej v mm. Lokálne reakcie HSL sa vyskytujú v priebehu 24 – 48 hodín, trvajú dlho, objavujú sa vo forme infiltrátu, niekedy s nekrózou v strede, a hodnotia sa podľa veľkosti infiltrátu v mm, aj pomocou systému plus. Pri cytotoxických a imunokomplexných typoch HNT sa hyperémia a infiltrácia pozorujú po 3-4 hodinách, maximum dosahujú po 6-8 hodinách a ustupujú približne po dni. Niekedy sa pozorujú kombinované reakcie.

1.3. REAKCIA FIXÁCIE DOPLNKU (FFR)

Táto reakcia sa používa, keď laboratórny výskum na detekciu protilátok v krvnom sére počas rôzne infekcie ako aj na identifikáciu patogénu podľa jeho antigénnej štruktúry.

Reakcia fixácie komplementu je komplexná. sérologické reakcie a má vysokú citlivosť a špecifickosť.

Charakteristickým rysom tejto reakcie je, že zmena antigénu počas jeho interakcie so špecifickými protilátkami nastáva iba v prítomnosti komplementu. Komplement sa adsorbuje iba na komplexe „antigén protilátky“. Komplex „antigén protilátky“ sa vytvorí iba vtedy, ak existuje afinita medzi antigénom a protilátkou v sére.

Adsorpcia komplementu na komplexe „antigénovej protilátky“ môže mať rôzne účinky na osud antigénu v závislosti od jeho charakteristík.

Niektoré z antigénov podliehajú za týchto podmienok prudkým morfologickým zmenám, vrátane rozpustenia (hemolýza, Isaev-Pfeifferov fenomén, cytolytické pôsobenie). Iní menia rýchlosť pohybu (imobilizácia treponému). Ešte iní zomierajú bez náhleho deštruktívne zmeny(baktericídny alebo cytotoxický účinok). Nakoniec, adsorpcia komplementu nemusí byť sprevádzaná zmenami antigénu, ktoré sú ľahko pozorovateľné.

Podľa mechanizmu RSC prebieha v dvoch fázach:

1. Prvou fázou je vytvorenie komplexu „antigénových protilátok“ a adsorpcia na tento komplementový komplex. Výsledok fázy nie je vizuálne viditeľný (interakcia antigénu a protilátok s povinnou účasťou komplementu).
2. Druhou fázou je zmena antigénu pod vplyvom špecifických protilátok za prítomnosti komplementu. Výsledok fázy môže byť viditeľný vizuálne alebo neviditeľný (detekcia výsledkov reakcie pomocou indikátorového hemolytického systému (ovčie červené krvinky a hemolytické sérum).

K deštrukcii červených krviniek hemolytickým sérom dochádza iba vtedy, ak sa do hemolytického systému pridá komplement. Ak bol komplement predtým adsorbovaný na komplex antigén-protilátka, nenastáva hemolýza erytrocytov.

Výsledok experimentu sa hodnotí zaznamenaním prítomnosti alebo neprítomnosti hemolýzy vo všetkých skúmavkách. Reakcia sa považuje za pozitívnu, keď je hemolýza úplne oneskorená, keď je kvapalina v skúmavke bezfarebná a červené krvinky sa usadia na dne, negatívna, keď úplná lýza erytrocyty, keď je tekutina intenzívne sfarbená („lak“ krv). Stupeň oneskorenia hemolýzy sa hodnotí v závislosti od intenzity farby kvapaliny a veľkosti sedimentu červených krviniek na dne (++++, +++, ++, +).

V prípade, že zmeny v antigéne zostávajú neprístupné pre vizuálne pozorovanie, je potrebné použiť druhý systém, ktorý funguje ako indikátor, ktorý umožňuje posúdiť stav komplementu a vyvodiť záver o výsledku reakcie.

Tento indikátorový systém predstavujú zložky hemolytickej reakcie, ktorá zahŕňa ovčie erytrocyty a hemolytické sérum, ktoré obsahuje špecifické protilátky proti erytrocytom (hemolyzíny), ale neobsahuje komplement. Tento indikátorový systém sa pridá do skúmaviek hodinu po umiestnení hlavného RSC. Ak je reakcia fixácie komplementu pozitívna, potom sa vytvorí komplex protilátky a antigénu, ktorý na seba adsorbuje komplement. Keďže komplement sa používa v množstve potrebnom len na jednu reakciu a lýza erytrocytov môže nastať iba v prítomnosti komplementu, potom, keď je adsorbovaný na komplexe „antigénových protilátok“, dôjde k lýze erytrocytov v hemolytickom (indikátorovom) systéme. nenastať. Ak je reakcia fixácie komplementu negatívna, komplex „antigénová protilátka“ sa nevytvorí, komplement zostáva voľný a po pridaní hemolytického systému dochádza k lýze erytrocytov.

1.4. DNA SONDY. POLYMERÁZOVÁ REŤAZOVÁ REAKCIA (PCR),
IMUNOENZÝMOVÁ METÓDA (ELISA), METÓDA S FUNKČNÝMI PROTILÁTKAMI (FFA)

METÓDY GÉNOVÉHO SNÍMANIA

Intenzívny rozvoj molekulárnej biológie a vytvorenie dokonalej metodickej základne pre genetický výskum tvorili základ genetického inžinierstva. V oblasti diagnostiky sa objavil a rýchlo rozvíja smer určovania špecifických nukleotidových sekvencií DNA a RNA, takzvané génové sondovanie. Takéto techniky sú založené na schopnosti nukleových kyselín hybridizovať a vytvárať dvojvláknové štruktúry v dôsledku interakcie komplementárnych nukleotidov (AT, GC).

Na určenie požadovanej sekvencie DNA (alebo RNA) je špeciálne vytvorená takzvaná polynukleotidová sonda so špecifickou sekvenciou báz. Do jeho zloženia sa zavádza špeciálne označenie, ktoré umožňuje identifikovať tvorbu komplexu.

Hoci génové sondovanie nemožno klasifikovať ako metódu imunochemickej analýzy, jej základný princíp (interakcia komplementárnych štruktúr) je metodicky implementovaný rovnakým spôsobom ako indikátorové metódy imunodiagnostiky. Metódy génového sondovania navyše umožňujú doplniť informácie o infekčnom agens v neprítomnosti jeho fenotypovej expresie (vírusy zabudované v genóme, „tiché“ gény).

Na uskutočnenie analýzy DNA sa vzorka denaturuje, aby sa získali jednovláknové štruktúry, s ktorými reagujú molekuly sondy DNA alebo RNA. Na prípravu sond sa používajú buď rôzne úseky DNA (alebo RNA) izolované z prirodzeného zdroja (napríklad konkrétneho mikroorganizmu), zvyčajne prezentované vo forme genetických sekvencií vo vektorových plazmidoch, alebo chemicky syntetizované oligonukleotidy. V niektorých prípadoch sa ako sonda používajú prípravky genómovej DNA hydrolyzované na fragmenty, niekedy prípravky RNA a najmä často ribozomálna RNA. Ako označenie sa používajú rovnaké indikátory ako pre rôzne druhy imunochemická analýza: rádioaktívne izotopy, fluoresceíny, biotop (s ďalším prejavom enzýmovým komplexom avidín) atď.

Poradie analýzy je určené vlastnosťami dostupnej sondy

V súčasnosti sa čoraz viac využívajú komerčné súpravy obsahujúce všetky potrebné zložky.

Vo väčšine prípadov možno postup analýzy rozdeliť do nasledujúcich etáp: príprava vzorky (vrátane extrakcie a denaturácie DNA), fixácia vzorky na nosiči (najčastejšie polymérový membránový filter), prehybridizácia, samotná hybridizácia, premytie nenaviazaných produktov, detekcia . V neprítomnosti štandardného preparátu DNA alebo RNAprobe sa najskôr získa a označí.

Na prípravu vzorky môže byť potrebné predbežne „pestovať“ testovaný materiál na identifikáciu jednotlivých kolónií baktérií alebo zvýšenie koncentrácie vírusov v bunkovej kultúre. Vykonáva sa aj priama analýza vzoriek krvného séra, moču, krviniek alebo plnej krvi na prítomnosť infekčného agens. Na uvoľnenie nukleových kyselín z bunkových štruktúr sa uskutočňuje bunková lýza a v niektorých prípadoch sa prípravok DNA čistí pomocou fenolu.

Pri pôsobení alkálií dochádza k denaturácii DNA, teda k jej prechodu na jednovláknovú formu. Vzorka nukleovej kyseliny sa potom fixuje na nosič, nitrocelulózovú alebo nylonovú membránu, zvyčajne inkubáciou počas 10 minút až 4 hodín pri 80 °C vo vákuu. Ďalej, v procese prehybridizácie sa dosiahne inaktivácia voľných väzbových miest, aby sa znížila nešpecifická interakcia sondy s membránou. Proces hybridizácie trvá od 2 do 20 hodín v závislosti od koncentrácie DNA vo vzorke, koncentrácie použitej sondy a jej veľkosti.

Po dokončení hybridizácie a odmytí nenaviazaných produktov sa deteguje vytvorený komplex. Ak sonda obsahuje rádioaktívnu značku, potom sa na demonštráciu reakcie membrána vystaví fotografickému filmu (autorádiografia). Pre ostatné štítky sa používajú zodpovedajúce postupy.

Najperspektívnejšie je získať nerádioaktívne (tzv. studené) sondy. Na rovnakom základe sa vyvíja hybridizačná technika, ktorá umožňuje stanoviť prítomnosť patogénu v preparátoch rezov a tkanivových punkciách, čo je obzvlášť dôležité pri patomorfologickej analýze (hybridizácia in situ).

Významnou etapou vo vývoji metód génového sondovania bolo použitie polymerázová reakcia amplifikácie (PCR). Tento prístup umožňuje zvýšiť koncentráciu špecifickej (vopred známej) sekvencie DNA vo vzorke syntetizovaním viacerých kópií in vitro. Na uskutočnenie reakcie sa do skúmanej vzorky DNA pridá prípravok enzýmu DNA polymerázy, nadbytok deoxynukleotidov na syntézu a takzvané priméry - dva typy oligonukleotidov s veľkosťou 2025 báz zodpovedajúcich koncovým úsekom DNA. Požadovaná sekvencia DNA. Jeden z primérov by mal byť kópiou začiatku čítacej oblasti kódujúceho reťazca DNA v smere 53 čítania a druhý by mal byť kópiou opačného konca nekódujúceho reťazca. Potom sa s každým cyklom polymerázovej reakcie počet kópií DNA zdvojnásobí.

Aby sa dosiahlo naviazanie primeru, je potrebná denaturácia DNA (topenie) pri 94 °C, po ktorej nasleduje zahriatie zmesi na 40-55 °C.

Na uskutočnenie reakcie boli navrhnuté programovateľné mikrovzorkové inkubátory, aby sa ľahko striedali zmeny optimálnej teploty pre každý stupeň reakcie.

Amplifikačná reakcia môže významne zvýšiť citlivosť analýzy počas génového sondovania, čo je obzvlášť dôležité pri nízkych koncentráciách infekčného agens.

Jednou z významných výhod génového sondovania s amplifikáciou je schopnosť študovať submikroskopické množstvá patologického materiálu.

Ďalšou vlastnosťou metódy, dôležitejšou pre analýzu infekčného materiálu, je schopnosť identifikovať skryté (tiché) gény. Metódy spojené s využívaním génového sondovania budú určite širšie zavedené do praxe diagnostiky infekčných chorôb, keďže budú jednoduchšie a lacnejšie.

Metódy ELISA a RIF majú prevažne kvalitatívny alebo semikvantitatívny charakter. Pri veľmi nízkych koncentráciách zložiek nemožno tvorbu komplexu antigén protilátky detekovať ani vizuálne, ani jednoduchými inštrumentálnymi prostriedkami. Indikácia komplexu antigén-protilátka sa v takýchto prípadoch môže uskutočniť, ak sa do jednej z východiskových zložiek antigén alebo protilátka zavedie značka, ktorá sa dá ľahko detegovať v koncentráciách porovnateľných so stanovenou koncentráciou analytu.

Ako značky sa môžu použiť rádioaktívne izotopy (napríklad 125I), fluorescenčné látky a enzýmy.

V závislosti od použitej značky existujú metódy analýzy rádioimunitné (RIA), fluorescenčné imunitné (FIA), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) atď. posledné rokyširoký praktické využitie dostali ELISA, čo je spojené s možnosťou kvantitatívnych stanovení, vysokou senzitivitou, špecifickosťou a automatizáciou účtovania.

Enzýmové imunoanalytické metódy sú skupinou metód, ktoré umožňujú detekciu komplexu antigén-protilátka pomocou substrátu, ktorý je štiepený enzýmom a vytvára farbu.

Podstatou metódy je spojenie zložiek reakcie antigénovej protilátky s nameraným enzýmovým značením. Antigén alebo protilátka, ktorá reaguje, je označená enzýmom. Na základe transformácie substrátu pôsobením enzýmu je možné posúdiť množstvo interagujúcej zložky reakcie antigénovej protilátky. Enzým v tomto prípade slúži ako marker imunitnej reakcie a umožňuje ju pozorovať vizuálne alebo inštrumentálne.

Enzýmy sú veľmi vhodné značky, pretože ich katalytické vlastnosti im umožňujú pôsobiť ako zosilňovače, pretože jedna molekula enzýmu môže podporiť tvorbu viac ako 1 × 105 molekúl produktu katalytickej reakcie za minútu. Je potrebné vybrať enzým, ktorý si dlhodobo zachováva svoju katalytickú aktivitu, nestráca ju pri väzbe na antigén alebo protilátku a má vysokú špecifickosť voči substrátu.

Hlavné metódy produkcie enzýmom značených protilátok alebo antigénov a konjugátov sú: chemické, imunologické a genetické inžinierstvo. Najčastejšie používané enzýmy na ELISA sú chrenová peroxidáza, alkalická fosfatáza, galaktozidáza atď.

Na detekciu enzýmovej aktivity v komplexe antigén-protilátka za účelom vizuálneho a inštrumentálneho záznamu reakcie sa používajú chromogénne substráty, ktorých roztoky, spočiatku bezfarebné, počas enzymatickej reakcie získavajú farbu, ktorej intenzita je úmerná množstvu enzýmu. Na detekciu aktivity chrenovej peroxidázy v teste ELISA na pevnej fáze sa teda ako substrát používa kyselina 5-aminosalicylová, ktorá vytvára intenzívne hnedé sfarbenie, a ortofenyléndiamín, ktorý vytvára oranžovo-žlté sfarbenie. Na zistenie aktivity alkalický fosfát a β-galatozidázy používajú nitrofenylfosfáty a nitrofenylgalaktozidy, v danom poradí.

Výsledok reakcie pri vzniku farebného produktu sa stanoví vizuálne alebo pomocou spektrofotometra, ktorý meria absorpciu svetla s určitou vlnovou dĺžkou.

Existuje veľa možností na vykonanie ELISA. Existujú homogénne a heterogénne možnosti.

Podľa spôsobu výroby sa rozlišujú kompetitívne a nekonkurenčné metódy ELISA. Ak je v prvom štádiu v systéme prítomná len analyzovaná zlúčenina a jej zodpovedajúce väzbové centrá (antigén a špecifické protilátky), potom je metóda nekompetitívna. Ak je v prvej fáze prítomná analyzovaná zlúčenina (antigén) a jej analóg (enzýmom značený antigén), ktoré si navzájom konkurujú o väzbu na špecifické väzbové centrá (protilátky), ktorých je nedostatok, potom je metóda kompetitívna. V tomto prípade platí, že čím viac testovacích antigénov roztok obsahuje, tým menší je počet naviazaných značených antigénov.

METÓDA FLUORESCENČNÝCH PROTILÁTOK (MFA) alebo IMUNOFLUORESCENČNÁ REAKCIA (RIF)

Imunofluorescenčná metóda je metódou voľby na rýchlu detekciu a identifikáciu neznámeho mikroorganizmu v testovanom materiáli.

Ag + AT + elektrolyt = komplex žiariaci v UV lúčoch

Mikróbové sérum označené fluorochrómom

Často používaným farbivom je fluoresceín izotiokyanát FITC

Pri štúdiu tejto metódy sa používa fluorescenčný mikroskop.

Inscenácia RIF

Na náter sa aplikuje 30 μl roztoku protilátky značenej FITC.

Umiestnite pohár do vlhkej komory a nechajte ho pri izbovej teplote 20-25 minút, alebo v termostate pri 37°C na 15 minút.

Umyte sklo v bežiacej stroji voda z vodovodu 2 minúty opláchnite destilovanou vodou a vysušte na vzduchu.

Na vysušený náter sa nanesie kvapka montážnej kvapaliny, náter sa prekryje krycím sklíčkom a mikroskopuje sa pomocou fluorescenčného mikroskopu alebo fluorescenčného nástavca na bežný optický mikroskop.

/ 50
Najhoršie Najlepšie

Tieto reakcie zahŕňajú antigény vo forme častíc (mikrobiálnych buniek, červených krviniek a iných korpuskulárnych antigénov), ktoré sú navzájom zlepené protilátkami a precipitujú.

Podľa typu použitej imunodiagnostiky sa rozlišujú reakcie mikrobiálnej aglutinácie, hemaglutinácie, latexovej aglutinácie, koagulácie atď.

Na diagnostiku infekčných chorôb sa aglutinačná reakcia uskutočňuje v dvoch smeroch: pomocou diagnostického aglutinačného séra (sérologická identifikácia mikróba) sa určí typ patogénneho mikróba izolovaného od pacienta a pomocou štandardného mikrobiálneho séra sa zisťujú špecifické protilátky v sére pacienta. diagnosticum (sérodiagnostika ochorenia, sérologická diagnóza).

Existujú priame čiary a nepriama reakcia aglutinácia

Priama mikrobiálna aglutinačná reakcia (RA). Pri tejto reakcii protilátky (aglutiníny) priamo aglutinujú korpuskulárne antigény (aglutanogény). Zvyčajne sú reprezentované suspenziou inaktivovaných mikroorganizmov (mikrobiálna aglutinačná reakcia). Na základe povahy vytvoreného aglutinátu sa rozlišuje granulovaná a flokulentná aglutinácia. Granulovaná aglutinácia nastáva, keď sa mikróby obsahujúce O-antigén zlepia. Baktérie s bičíkmi (H-antigén) aglutinujú za vzniku veľkých vločiek.

Na určenie typu mikroorganizmov sa používajú štandardné diagnostické aglutinačné séra. Získavajú sa hyperimunizáciou laboratórnych zvierat suspenziou baktérií. Titer takéhoto séra je jeho najvyšším zriedením, pri ktorom sa pozoruje jasná aglutinácia zodpovedajúceho antigénu. Vzhľadom na zložitosť antigénnej štruktúry baktérií však aglutinačné séra obsahujú protilátky nielen proti druhovo špecifickým, ale aj skupinovým antigénom a môžu spôsobiť skupinovú aglutináciu s príbuznými druhmi baktérií. Titre protilátok voči druhovo špecifickým antigénom v sére sú vždy vyššie ako voči skupinovým antigénom. Na odstránenie skupinovo špecifických protilátok sa do séra postupne pridávajú mikroorganizmy obsahujúce skupinové antigény (metóda Castellani). Táto metóda produkuje adsorbované séra, ktoré obsahujú protilátky proti určitý typ mikrób

Metódy aglutinačnej reakcie. Najbežnejšie sú lamelárne (približné) a rozšírené RA. Doska RA sa položí na sklo. Pri tejto reakcii sa používajú mierne zriedené alebo neriedené séra. Používa sa ako zrýchlená metóda na detekciu protilátok alebo identifikáciu mikroorganizmov. Na sklo sa nanesie kvapka séra, do ktorého sa slučkou zavedie neznáma bakteriálna kultúra, premieša sa a po 2-3 minútach sa pozoruje jemnozrnná alebo vločkovitá aglutinácia. Na kontrolu sa používa kvapka soľného roztoku, v ktorom sa po pridaní baktérií pozoruje zákal. Pri použití neadsorbovaných sér je reakcia na skle len orientačná.

Expandovaná RA sa vykonáva v skúmavkách alebo doštičkových jamkách. V tomto prípade sa diagnostické sérum zriedi na titer a pridá sa rovnaké množstvo antigénu. O pozitívny výsledok Na dne skúmavky sa vytvorí sypký sediment vo forme „dáždnika“, pri negatívnom sa vytvorí sediment vo forme „gombíka“. Keďže titre skupinovo špecifických protilátok v sére sú oveľa nižšie ako titre druhovo špecifických protilátok, skupinové reakcie sa pozorujú len pri malých riedeniach séra. Ak dôjde k aglutinácii pred titrom alebo do polovice titra séra, je to druhovo špecifické.

Na stanovenie protilátok v sére pacienta (sérologická diagnostika) sa používa štandardné mikrobiálne diagnostikum, obsahujúce suspenziu známych mikróbov alebo ich antigénov. V tomto prípade je tiež možné nainštalovať platňu a nasadiť RA.

Priama aglutinačná reakcia buniek. Na stanovenie krvných skupín sa používajú štandardné darcovské krvné séra obsahujúce známe anti-A alebo anti-B protilátky. Reakcie sa uskutočňujú na skle alebo platniach. Ak majú erytrocyty A (2. krvná skupina), B (3. krvná skupina) alebo oba antigény (4. krvná skupina), zodpovedajúce séra aglutinujú erytrocyty. Používa sa aj test krvnej kompatibility, kde sa zmiešajú kvapky krvi od darcu a príjemcu a posúdi sa aglutinácia.

Kliniky využívajú aglutinačnú reakciu leukocytov, krvných doštičiek a iných buniek na identifikáciu autoprotilátok, ako aj na stanovenie antigénov na týchto bunkách.

Nepriama (pasívna) aglutinačná reakcia. Na dosiahnutie fenoménu aglutinácie sa antigén vopred adsorbuje na korpuskulárnom nosiči, ktorým sú inertné častice (latex, celulóza, polystyrén, oxid bárnatý atď.) alebo bunky (ovčie červené krvinky, ľudská krvná skupina I(0) ).

Pri pasívnej hemaglutinačnej reakcii (RPHA) sa ako nosič využívajú červené krvinky. Antigénom nabité červené krvinky sa zlepia v prítomnosti špecifických protilátok proti tomuto antigénu a vyzrážajú sa. Antigénom senzibilizované erytrocyty sa v RPGA používajú ako erytrocytárne antigénové diagnostiko na detekciu protilátok (sérodiagnostika, sérologická diagnostika). Ak sú červené krvinky nabité protilátkami, môžu sa použiť na detekciu antigénov.

Priame a nepriame antiimunoglobulínové Coombsove reakcie. Používa sa na detekciu „neúplných“ (neaglutinujúcich) protilátok, ktoré sa tvoria pri rôzne choroby: Rhesus konflikt, autoimunitné ochorenia, niektoré infekcie. Na vyvolanie týchto reakcií je potrebné antiglobulínové sérum, ktoré sa získa imunizáciou králika ľudskými imunoglobulínmi. Toto sérum obsahuje kompletné (bivalentné) anti-imunoglobulínové protilátky.

Priama reakcia: do premytých erytrocytov z krvi pacienta sa pridá antiimunoglobulínové sérum. Ak sú na červených krvinkách neúplné protilátky (imunoglobulíny), čo sa pozoruje pri hemolytická anémia, Rhesus konflikt (fetálne červené krvinky), potom aglutinujú.

Nepriama reakcia odhalí voľné antierytrocytové protilátky v krvnom sére pacienta. K tomuto séru sa pridajú premyté erytrocyty od darcu krvnej skupiny 0(I). Zmes sa inkubuje pri 37 °C počas 30 minút a červené krvinky sa premyjú. Potom sa k nim pridá anti-imunoglobulínové sérum. Ak sérum pacienta malo neúplné protilátky proti erytrocytom, dôjde k aglutinácii.

Aglutinácia je zlepovanie baktérií v dôsledku interakcie špecifických AT s nimi. Na uskutočnenie RA sú potrebné tri zložky: 1) AG (aglutinogén); 2) AT (aglutinín); 3) roztok elektrolytu (izotonický roztok chloridu sodného). Na aglutinačnej reakcii sa zúčastňujú iba korpuskulárne antigény (baktérie, červené krvinky, latexové častice s antigénom).

Aglutinačná reakcia na skle. Na podložné sklíčko bez tuku sa pipetou nanesie kvapka diagnostického séra (riedenie séra 1:10 - 1:20). Pomocou bakteriologickej slučky sa z povrchu šikmého agaru odoberie čistá kultúra skúmaného mikroorganizmu, prenesie sa do kvapky séra a premieša sa. Výsledok reakcie sa berie do úvahy voľným okom po 3-5 minútach. Ak je reakcia pozitívna, v kvapke séra sa zaznamenajú vločky (veľké alebo malé), ktoré sú zreteľne viditeľné na tmavom pozadí, keď sa sklíčko potrasie. V prípade negatívnej reakcie zostáva kvapalina rovnomerne zakalená.

Aglutinačná reakcia v skúmavkách. Do radu skúmaviek sa pridá 1 ml fyziologického roztoku. Do prvej skúmavky sa pridá rovnaký objem testovaného krvného séra. Pripravia sa sériové dvojnásobné riedenia séra (titrácia séra), po ktorých sa do každej skúmavky pridajú 2 kvapky suspenzie inaktivovaných baktérií (diagnosticum). Skúmavky sa umiestnia na 2 hodiny do termostatu pri 37 °C. Reakcia prebieha za vzniku malých vločiek, voľným okom neviditeľných, preto sa výsledky zaznamenávajú pri miernom zväčšení v špeciálnom prístroji – aglutinoskope. Intenzita aglutinácie sa berie do úvahy podľa systému „štyri plus“: úplná aglutinácia - 4+, čiastočná aglutinácia - 3+ alebo 2+, sporný výsledok - +. Posledné riedenie, pri ktorom sa pozoruje aglutinácia 2+, sa považuje za titer protilátky v testovacom sére.

Na stanovenie titra protilátok proti pôvodcom týfusu a paratýfusu (Vidalova reakcia), brucelózy (Wrightova reakcia) a týfusu (Weiglova reakcia) sa vykonáva aglutinačná reakcia v skúmavkách (rozsiahla aglutinačná reakcia).

Aglutinácia (z lat. aglutinatio - lepenie) je zlepovanie (spájanie) korpuskulárnych častíc nesúcich antigén (celé bunky, latexové častice a pod.) s molekulami špecifických protilátok za prítomnosti elektrolytov, ktoré končí tvorbou vločiek alebo sedimentu. (aglutinovať) viditeľné voľným okom. Povaha sedimentu závisí od povahy antigénu: bičíkovité baktérie produkujú hrubý vločkovitý sediment, bičíkovité a nekapsulárne baktérie produkujú jemnozrnný sediment a kapsulárne baktérie vytvárajú vláknitý sediment. Rozlišuje sa priama aglutinácia, pri ktorej sa na interakcii so špecifickými protilátkami priamo podieľajú vlastné antigény bakteriálnej alebo akejkoľvek inej bunky, ako sú erytrocyty; a nepriame alebo pasívne, v ktorých sú bakteriálne bunky alebo erytrocyty alebo latexové častice nosičmi nie vlastnými, ale cudzími antigénmi (alebo protilátkami), ktoré sú na nich sorbované, aby sa identifikovali protilátky (alebo antigény), ktoré sú pre ne špecifické. Aglutinačná reakcia zahŕňa hlavne protilátky súvisiace s triedy IgG a IgM. Prebieha v dvoch fázach: po prvé, dochádza k špecifickej interakcii medzi aktívnym centrom protilátok a determinantom antigénu, toto štádium môže nastať v neprítomnosti elektrolytov a nie je sprevádzané viditeľnými zmenami v reagujúcom systéme. Pre druhý stupeň - tvorbu aglutinátu - je potrebná prítomnosť elektrolytov, ktoré znižujú elektrický náboj komplexov antigén + protilátka a urýchľujú proces ich zlepovania. Táto fáza končí tvorbou aglutinátu.

Aglutinačné reakcie sa uskutočňujú buď na sklenených alebo hladkých kartónových platniach, alebo v sterilných aglutinačných skúmavkách. Aglutinačné reakcie (priame a pasívne) na skle sa zvyčajne používajú ako zrýchlená metóda na detekciu špecifických protilátok v sére pacienta (napríklad pri brucelóze) alebo na sérologickú identifikáciu patogénu. V druhom prípade sa zvyčajne používajú dobre purifikované (adsorbované) diagnostické séra obsahujúce iba monoreceptorové protilátky alebo ich sadu na rôzne antigény. Nepochybnou výhodou aglutinačnej reakcie na skle je jednoduchosť jej realizácie a skutočnosť, že trvá niekoľko minút až sekúnd, keďže obe zložky sú použité v koncentrovanej forme. Má však len kvalitatívnu hodnotu a je menej citlivý ako skúmavka. Rozsiahla aglutinačná reakcia v skúmavkách poskytuje presnejšie výsledky, pretože umožňuje určiť kvantitatívny obsah protilátok v sére (stanoviť ich titer) a v prípade potreby zaregistrovať skutočnosť zvýšenia titra protilátok, ktorá má diagnostickú hodnotu. . Na nastavenie reakcie sa pridá sérum zriedené určitým spôsobom 0,85 % roztokom NaCl a rovnaký objem (zvyčajne 0,5 ml) suspenzie štandardného diagnostika (alebo testovacej kultúry) obsahujúcej 1 miliardu baktérií v 1 ml. aglutinačné trubice. Výsledky aglutinačnej reakcie sa zaznamenávajú najskôr po 2 hodinách inkubácie skúmaviek pri 37 °C a nakoniec po 20 až 24 hodinách podľa dvoch kritérií: prítomnosť a veľkosť precipitátu a stupeň priehľadnosti kvapaliny nad usadeninou. Hodnotenie sa vykonáva podľa štvorkrížového systému. Reakcia je nevyhnutne sprevádzaná kontrolou séra a antigénu. V prípadoch, keď sa na sérologickú identifikáciu patogénu vykonáva podrobná aglutinačná reakcia v skúmavke, má diagnostickú hodnotu, ak je reakcia vyhodnotená ako pozitívna pri zriedení diagnostického séra aspoň na polovicu jeho titra.

Je potrebné vziať do úvahy, že pri miešaní roztokov homológnych antigénov a protilátok nie sú vždy pozorované viditeľné prejavy aglutinačnej reakcie. Zrazenina vzniká len pri určitých optimálnych pomeroch oboch reakčných zložiek. Mimo týchto limitov sa pri výraznom prebytku antigénu alebo protilátok nepozoruje žiadna reakcia. Tento jav sa nazýva „fenomén prozóny“. Pozoruje sa tak pri aglutinačnej reakcii, ako aj pri precipitačnej reakcii. Výskyt prozónu v imunitných reakciách sa vysvetľuje skutočnosťou, že antigény, ktoré sa na nich podieľajú, sú spravidla polydeterminantné a molekuly IgG protilátky majú dve aktívne centrá. Pri nadbytku protilátok je povrch každej častice antigénu pokrytý molekulami protilátky, takže nezostávajú žiadne voľné determinantné skupiny, takže druhé, neviazané aktívne centrum protilátok nemôže interagovať s inou časticou antigénu a viazať ich na seba. Tvorba viditeľného aglutinátu alebo precipitátu je potlačená aj pri nadbytku antigénu, kedy protilátkam nezostane ani jedno voľné aktívne centrum, a preto sa komplexy antigén + protilátka + antigén už nemôžu zväčšovať.

Možnosti zrýchlených aglutinačných reakcií. Pasívna hemaglutinačná reakcia a jej varianty

Klasická aglutinačná reakcia zahŕňa použitie korpuskulárnych antigénov. Avšak môžu byť zahrnuté aj rozpustné antigény. Aby to bolo možné, takéto antigény sa adsorbujú na imunologicky inertné častice. Ako nosič možno použiť častice latexu alebo bentonitu, v súčasnosti sa však najčastejšie používajú zvieracie alebo ľudské erytrocyty, ktoré zlepšujú svoje adsorpčné vlastnosti úpravou roztokmi tanínu, formalínu alebo benzidínu. Červené krvinky, ktoré na seba adsorbovali antigén, sa nazývajú senzibilizované týmto antigénom a imunitná reakcia, na ktorej sa zúčastňujú, sa nazýva nepriama alebo pasívna hemaglutinačná reakcia (IRHA alebo RPHA), pretože červené krvinky sa na nej zúčastňujú pasívne.

RPGA je umiestnený v špeciálnych polystyrénových platniach s otvormi s polguľovým dnom. Pri jeho použití na sérologickú diagnostiku sa v týchto jamkách pripravia dvojnásobné riedenia testovaného séra vo fyziologickom roztoku a následne sa k nemu pridá suspenzia senzibilizovaných erytrocytov ako diagnostický prostriedok. Výsledky sa zaznamenávajú po 2 hodinách inkubácie pri 37 °C s použitím štvorkrížového systému. Pri pozitívnej reakcii sa aglutinované červené krvinky usadia na dne jamky a rovnomerne ju zakryjú vo forme obráteného dáždnika. Ak je reakcia negatívna, červené krvinky sa tiež usadia, kvapalina sa vyjasní a sediment vyzerá ako malý „kotúč“ v strede jamky. Sérový titer v RPHA sa považuje za jeho posledné riedenie, ktoré stále poskytuje výraznú hemaglutináciu bez výrazných známok prítomnosti „disku“.

RPGA možno použiť aj ako zrýchlenú metódu bakteriologickej diagnostiky na zistenie neznámych baktérií, vírusov, toxínov priamo v testovanom materiáli, napríklad morových patogénov, stafylokokových enterotoxínov atď. S touto verziou RPGA sa erytrocyty, ktoré sa adsorbovali špecifickosť sa používajú ako známa zložka reakcie protilátky - protilátka erytrocytum diagnosticum. Ak testovaný materiál obsahuje dostatočné množstvo známeho antigénu, RPGA bude pozitívny.

Možnosti použitia RPHA sú: reakcia neutralizácie antigénu (RNAg), reakcia neutralizácie protilátky (RNAb), reakcia pasívnej inhibície hemaglutinácie (PHA). Pri týchto reakciách sa používa antigénová a protilátková erytrocytová diagnostika. Súčasne je možné použiť dve vzájomne sa ovládajúce jednosmerné reakcie, napríklad RPHA s antigénovým diagnostikom a RNAg s protilátkovým erytrocytovým diagnostikom.

Protilátková neutralizačná reakcia (RNAb) pozostáva zo zmiešania suspenzie obsahujúcej požadovaný antigén so špecifickým imunitným sérom obsahujúcim známe protilátky vo vhodných objemoch a inkubácie pri teplote 37 °C počas dvoch hodín. Potom sa pridá antigénne erytrocytové diagnosticum. Zmes sa pretrepe a nechá sa pri teplote miestnosti. Výsledky sa berú do úvahy po 3-4 hodinách a nakoniec po 18-24 hodinách.Ak testovaný materiál obsahuje antigén, bude viazať protilátky (neutralizovať ich), a preto nedôjde k hemaglutinácii.

Reakcia neutralizácie antigénu (RNAg) sa uskutočňuje na rovnakom princípe. Iba v tomto prípade sa v testovanom materiáli detegujú protilátky. Špecifický antigén pridaný k takému testovanému materiálu sa naviaže na protilátky v ňom obsiahnuté, to znamená, že dôjde k neutralizácii antigénu protilátkami, a preto pri pridaní protilátky na diagnostiku erytrocytov nedôjde k hemaglutinácii.

Koaglutinačná reakcia. Je to jedna z možností pasívnej, teda zrýchlenej aglutinačnej reakcie na skle sprostredkovanej bunkami nesúcimi protilátky. Táto reakcia je založená na jedinečná nehnuteľnosť Staphylococcus aureus, ktorý vo svojej bunkovej stene obsahuje proteín A, sa viaže na Fc fragmenty IgG a IgM. V tomto prípade zostávajú aktívne centrá protilátok voľné a môžu interagovať so špecifickými determinantami antigénov. Na podložné sklíčko sa nanesie kvapka 2 % suspenzie stafylokokov senzibilizovaných vhodnými protilátkami a pridá sa kvapka suspenzie študovaných baktérií. Ak sa antigén zhoduje s protilátkami, dôjde v priebehu 30-60 s k jasnej aglutinácii stafylokokov naložených protilátkami.

Latexová aglutinačná reakcia (LAR). Nosičom protilátok v tomto diagnostickom systéme sú malé štandardné latexové častice. Reakcia sa uskutočňuje pomocou mikrometódy v jamkách na skle. Hlavnou podmienkou úspešného stagingu PAH je prísne dodržiavanie kvantitatívnych pomerov zložiek systému: do 50 μl testovaného materiálu sa pridá 10 μl latexového prípravku senzibilizovaného protilátkami. Špecifickosť PAH sa kontroluje pomocou troch kontrolných testov obsiahnutých v komerčných testovacích systémoch: známa pozitívna reakcia, známa negatívna reakcia a kontrola kvality latexových suspenzií s použitím latexov nesenzibilizovaných PAH (neobsahujúcich protilátky) s testovaným materiálom. U nás sa ako nosiče špecifických protilátok používajú polystyrénové monodisperzné latexy s rôznymi priemermi častíc (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). LAG sa používa na rýchlu detekciu mikroorganizmov alebo ich antigénov v testovanom materiáli.

Imunomagnetická detekcia antigénov. Jedna z možností zrýchlenej aglutinačnej reakcie na skle je spojená s použitím supermagnetických polymérnych častíc potiahnutých špecifickými protilátkami. Jedna takáto častica viaže až 107-108 buniek mikroorganizmov, vďaka čomu je citlivosť túto metódu dosahuje 5 CFU/ml. Imunomagnetickú detekciu mikroorganizmov možno použiť v kombinácii s KPR.

Agregátna hemaglutinačná reakcia (AHA). Umožňuje rýchlo odhaliť v krvi pacientov ako voľne cirkulujúce antigény (antigenémia), tak aj antigény spojené s protilátkami – cirkulujúce imunitné komplexy (CIC). Pri RAHA sa používajú červené krvinky senzibilizované vhodnými protilátkami. Pridanie krvného séra pacienta, ktoré obsahuje antigény, k senzibilizovaným erytrocytom, na ktorých sú fixované protilátky, vedie k zlepeniu (aglutinácii) erytrocytov a imunitných komplexov.

Antiglobulínový Coombsov test (R. Coombsova reakcia). Úplné (divalentné) protilátky sa stanovujú pomocou priamych a pasívnych aglutinačných reakcií. Nekompletné (monovalentné, blokujúce) protilátky sa týmito metódami nedetekujú, pretože keď sa spoja s antigénom, blokujú ho, ale nemôžu spôsobiť agregáciu antigénu do veľkých konglomerátov. Neúplné (blokujúce) protilátky sú tie, v ktorých funguje iba jedno aktívne centrum; druhé aktívne centrum z neznámeho dôvodu nefunguje. Na detekciu neúplných protilátok sa používa špeciálna Coombsova reakcia (obr. 72). Reakcia zahŕňa: sérum pacienta, v ktorom sú stanovené neúplné protilátky, korpuskulárny antigén-diagnostika, antiglobulínové sérum obsahujúce protilátky proti ľudskému globulínu. Reakcia prebieha v dvoch fázach:

Interakcia antigénu s nekompletnými protilátkami. Neexistujú žiadne viditeľné prejavy. Prvý stupeň je ukončený premytím antigénu zo zvyšného séra pacienta.

Interakcia antiglobulínového séra získaného ako výsledok imunizácie zvieraťa ľudským globulínom s neúplnými protilátkami adsorbovanými na antigén. Vzhľadom na to, že antiglobulínové protilátky sú bivalentné, viažu na seba dve monovalentné protilátky samostatných komplexov antigén + neúplná protilátka, čo vedie k ich zlepeniu a vzniku viditeľného precipitátu.

Aglutinačná reakcia Aglutinačná reakcia

(RA) je metóda na identifikáciu a kvantifikáciu Ag a Ab na základe ich schopnosti vytvárať aglomeráty viditeľné voľným okom. Na oddelení infekčných chorôb. choroby alebo na iné účely sa používa na identifikáciu neznámych mikróbov a buniek, na stanovenie prítomnosti a množstva Ab v krvi a iných tekutinách. Princíp stanovenia je založený na špecifickosti interakcie medzi Ag a Ab a spočíva v hľadaní známeho od neznámeho. Existuje veľa možností pre RA: kvantitatívne a kvalitatívne, skúmavky a sklenené, objemové a kvapôčkové, konvenčné, zrýchlené a expresné metódy. Na štádium RA potrebujete: 1) s-ka krv. Vo variante s určením typu (var) baktérií sa používajú priemyselné aglutinačné testy vyrobené imunizáciou králikov. Vo variante s určením typu Ab sa z testu odoberie vzorka krvi. ľudí alebo zvierat. Roztok musí byť sterilný a bez suspendovaných častíc. Pripravte základné riedenie vo fyziologickom roztoku. Mal by byť 2-4 krát nižší ako diagnostický titer pre túto chorobu; 2) Ag. Vo verzii reakcie s určením typu Ab sa používajú priemyselné diagnostické súpravy; vo variante so stanovením Ag sa diagnostika pripravujú samy vo forme 1-3 miliárd suspenzie vo fyziologickom roztoku 18-20-hodinového agarového (menej často bujónového) testu. mikrób inaktivovaný zahrievaním vo vodnom kúpeli pri 70 °C počas 1 hodiny alebo 24-hodinovou inkubáciou pri 37 °C s formaldehydom (konečná koncentrácia 0,2 %); 3) elektrolyt vo forme soľného roztoku. Inscenačná technika objemová sériová skúmavka RA na stanovenie titra Ab v s-ki: z hlavného riedenia s-ki sa pripraví niekoľko radov pracovných riedení. Počet riadkov závisí od počtu diagnostík použitých v experimente, počet a faktory riedenia sú určené diagnostickým titrom podozrivého ochorenia. Séria musí obsahovať aspoň riedenie zodpovedajúce diagnostickému titru Ab, dve riedenia pod ním a dve riedenia nad ním. napríklad, ak je diagnostický titer 1:100, potom pri objemovej metóde stanovenia RA by sa mali pripraviť nasledujúce riedenia: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; s kvapkadlom metódou nie je potrebné prvé riedenie (1:25), ale je potrebné ďalšie vyššie riedenie - 1:800. vedecký výskum s-ku sa titruje do negatívnej reakcie. Riedi sa nasledovne: 0,25 ml fyziologického roztoku sa naleje do všetkých skúmaviek okrem 1., keď sa reakcia uskutočňuje v objeme 0,5 ml, a 0,5 ml, keď sa reakcia uskutočňuje v objeme 1. ml. Nalejte 0,25 (0,5) ml hlavného riedenia do 1. a 2. skúmavky z 2. skúmavky do odrezaného objemu a chovný s-k a zvýšená 2x sa prenesie 0,25 (0,5) ml na 3., z 3. na 4. atď. do posledného sa z odrezku naleje do všetkého 0,25 (0,5) ml, aby sa vyrovnali objemy. Každé riedenie sa vykonáva pomocou samostatnej pipety. Ak sa do experimentu vezme niekoľko diagnostik, potom sa pre každé z nich pripraví jeho vlastný rad riedení rovnakým spôsobom. Diagnosticum sa pridáva do každého riedenia skúmavky v objeme, ktorý sa rovná objemu skúmavky, v dôsledku čoho sa riedenie v každej skúmavke zdvojnásobí. Experiment zodpovedá kontrole s-ki (0,25 - 0,5 ml hlavného riedenia s-ki a rovnaké množstvo fyziologického roztoku) a kontrole Ag (0,25 - 0,5 ml diagnostika a rovnaké množstvo fyziologického roztoku). Ak sa v experimente použije niekoľko diagnostických prostriedkov, potom každý má svoju vlastnú antigénnu kontrolu. Stojan so skúmavkami sa dobre pretrepe a umiestni sa do termostatu pri 37 °C na 4 hodiny a potom sa nechá pri izbovej teplote do nasledujúceho dňa, po ktorom sa zaznamená PA na základe množstva sedimentu a stupňa vyčistenia. kvapalina. Stanovenie týchto indikátorov v závislosti od povahy aglutinátov sa vykonáva voľným okom na tmavom pozadí, v aglutinoskope alebo cez konkávny povrch zrkadla mikroskopu. Účtovanie začína kontrolami: kontrola C by mala byť priehľadná, Ag by malo byť rovnomerne zakalené (po pretrepaní skúmavky). Ak sú kontroly dobré, zistite prítomnosť a stupeň aglutinácie vo všetkých skúmavkách, ktoré sú označené plusmi: veľký sediment a úplné vyčistenie kvapaliny - 4 plusy; veľký sediment a neúplné čistenie kvapaliny - 3 plusy; 2 plusy sú zreteľný sediment a zreteľné čistenie kvapaliny. Potom sa určí titer: najvyššie riedenie s intenzitou aglutinácie najmenej 2 plusy. Výskum titru s-ki sa porovnávajú s diagnostickým titrom pre toto ochorenie. Ak sa vyšetruje titer. s-ki je 2-krát nižšia ako diagnostická hodnota, reakcia sa hodnotí ako pochybná; ak je titer rovnaký diagnostika - ako slabo pozitívne; ak je 2-4 krát vyššia, považuje sa za pozitívnu, ak je 8 a viac krát vyššia, považuje sa za výrazne pozitívnu. S rozšírenou distribúciou Ab zdravých ľudí Na hodnotenie RA sa používa zvýšenie titra Ab. Na určenie typu Ar v sériovom RA musí počet riadkov zodpovedať počtu použitému na identifikáciu diagnostické testy. Z hlavného riedenia diagnostického testu sa pripraví séria postupných dvojnásobných riedení rovnakým spôsobom ako pri RA na stanovenie titra Ab. Faktory riedenia závisia od titra aglutinačného testu. V experimente je potrebná prítomnosť riedenia rovnajúceho sa titru testu, ako aj 2, 4, 6, 8 krát nižšieho ako je napr. titer diagnostického testu je 1 3200, potom by ste mali použiť riedenia 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Rovnaký objem testovaného Ag sa pridá k riedeniam testu, výsledkom čoho je riedenie test sa zväčší 2-násobne.do experimentu sa pridajú 2 kontroly testu a Ag.Ak je do experimentu zapojených niekoľko s-k, tak každá potrebuje svoju kontrolu Po ukončení reakcie sa stojan silne pretrepe a umiestni v termostate pri 37 ° C. Výsledky sa berú do úvahy tak, ako je opísané vyššie Hodnotenie reakcie má vlastnosti Aby bolo možné vyvodiť záver o súlade štúdie. Ag vzaté do experimentu, titer reakcie musí zodpovedať aspoň polovici titru štandardného diagnostického testu Titre 1 4 a nižšie sa považujú za skupinovú reakciu Odkvapkávacia md staging RA sa od volumetrického líši tým, že s-ku sa riedi v objeme 1 ml, Ag sa používa vo vyššej koncentrácii (10 miliárd/ml) a pridáva sa 1 - 2 kvapky do skúmavky Riedenie liečiva po pridaní Ag sa považuje za nezmenené inak je spôsob nastavenia, zaznamenávania a vyhodnocovania podobný ako pri volumetrickej metóde.

(Zdroj: Slovník pojmov mikrobiológie)