Основные понятия. (МИК) - минимальная ингибирующая (подавляющая) концентрация -наименьшая концентрация антибиотика,которая подавляет видимый рост исследуемого микроорганизма in. Дополнительный материал к занятию. Критериями антимикробной активности препар
В принципе эта процедура сходна с определением МПК в жидкой "Среде. Готовят несколько чашек Петри со ступенчатыми разведениями антибиотика, растворенного в дайной среде. Добавляют расплавленный агар, чашки охлаждают, чтобы агар затвердел. На поверхности среды штрихом засевают культуры одной или нескольких бактерий и после инкубации в термостате в течение необходимого времени определяют минимальную концентрацию антибиотика, при которой подавляется рост бактерий. Одним из преимуществ этого метода перед методом титрования в жидкой среде является то, что разные участки одной и той же чашки можно засевать разными видами или штаммами бактерий. В результате величины МПК для нескольких бактерий можно определить в одном опыте (рис. 2.2).
- ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ
Этот метод применяется для определения концентрации антибиотика в растворе. Он состоит в следующем. Диски из фильтровальной бумаги, смоченные исследуемым раствором антибиотика, помещают на поверхность агаризованной среды, содержащей разведенную суспензию бактерий. После соответствующей инкубации поверхность агара, которая вначале была полупрозрачной, мутнеет из-за рассеяния света выросшими бактериями. Полупрозрачные зоны остаются лишь вокруг дисков фильтровальной бумаги, поскольку антибиотик диффундирует в агар и подавляет рост бактерий. Если диаметр этих зон определять при строго стандартных условиях, то он будет функцией логарифма концентрации антибиотика. Используя известные концентрации антибиотика, строят стандартную кривую, по которой можно определить концентрацию антибиотика в неизвестных растворах (рис. 2.3). Иногда вместо дисков из фильтровальной бумаги используют небольшие полые цилиндрики, поставленные на поверхность агаровой среды и содержащие раствор антибиотика.
- ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Активность антибиотиков in vitro зависит от условий определения (табл. 2.1). На определение активности влияют такие факторы, как состав среды, плотность инокулума, количество бактериальных клеток в иноку луме (величина инокулума).
/
Таблица 2.1. Факторы, влияющие на определение активности антибиотиков
Тест-организм
Состав среды (pH, ионы, сыворотка, антагонисты)
Величина и плотность инокулума (гетерогенность популяции, механизмы инактивации, попадание веществ-антагонистов)
Условия инкубации (время, температура, аэрация)
А. СОСТАВ СРЕДЫ
Рассмотрим в качестве примера антибиотик, подавляющий биосинтез одной из аминокислот. Если антибиотик испытывают в среде без этой аминокислоты, то кажется, что он обладает очень высокой активностью, другими словами, имеет низкую величину МПК. При испытании в "среде, содержащей аминокислоту, синтез которой он подавляет и которую бактерия может получать из среды, антибиотик будет казаться неактивным.
Помимо таких специфических эффектов часто наблюдается менее специфическое влияние среды, не связанное непосредственно с механизмом действия или с химической структурой антибиотика. Одним особенно интересным случаем является наличие в среде сыворотки. Ее вводят в среду при определении МПК, чтобы создать физиологические условия, напоминающие условия в крови. Многие антибиотики связываются с белками сыворотки крови (в особенности с альбумином), в результате число свободных молекул антибиотика, которые могут проникать в бактериальные клетки, снижается. Связывание антибиотика с белками сыворотки обычно коррелирует с липофильностью некоторых заместителей в его молекуле.
Очевидно, что условия определения МПК в жидкой среде отличаются от условий в плотной среде хотя бы потому, что в плотной среде присутствует агар. Агар, содержащий S03-rpyn- пы, может адсорбировать антибиотик, изменяя его диффундирующую способность, или адсорбировать растворенный кислород и некоторые компоненты питательной среды. Неудивительно поэтому, что величина МПК антибиотика в отношении данной бактерии зависит от того, определена ли она в жидкой или в плотной среде, даже если эти две среды, за исключением наличия или отсутствия агара, идентичны по составу. Нужно также помнить, что физиология клеток может различаться в зависимости от того, растут ли они поодиночке в жидкости или в виде колоний на поверхности плотной среды.
Очень сильное влияние на активность антибиотиков оказывает величина pH среды. Помимо второстепенных эффектов, как то влияние pH на скорость роста микроорганизмов и, следова-
тешыно, косвенное влияние на их восприимчивость, величина pH оказывает очень сильное и непосредственное действие на способность препарата проникать,в бактериальную клетку. Например, вещества в неионизированной форме лучше диффундируют через клеточную стейку и плазматическую мембрану, чем вещества в ионизированной форме. Таким образом, pH среды, определяя степень ионизации основного или.кислого антибиотика, может прямо влиять на скорость его проникновения в бактерии и, следовательно, на эффективность.
Б. ПЛОТНОСТЬ И ВЕЛИЧИНА БАКТЕРИАЛЬНОГО ИНОКУЛУМА
Плотность инокулума - это число засеваемых бактерий, отнесенное к объему, в котором они растут. Ее обычно выражают как число клеток в 1 мл культуры. Величина инокулума - общее число засеянных бактерий. На МПК многих антибиотиков не влияют вариации в плотности обычно используемого инокулума (103-106 бактерия/мл). Действительно, даже при очень низких концентрациях антибиотика, например 0,01 мкг/мл, отношение числа молекул антибиотика к числу бактериальных клеток остается очень большим (при концентрации антибиотика с мол. массой 1000, равной 0,01 мкг/мл, в 1 мл раствора содержится ~1012 молекул). Однако имеются некоторые исключения. Например, зачастую очень много молекул антибиотика адсорбируется на наружной поверхности бактериальной клетки. Если плотность бактерий высока, число свободных молекул антибиотика, которые могут проникнуть в клетку, очень сильно снижается. Кроме того, для подавления роста одной клетки часто бывает необходимо большое количество молекул антибиотика. По мере роста бактерии синтезируют и выделяют в среду ферменты, которые могут разрушать антибиотик (например, р-лакта- мазы, действующие на р-лактамные антибиотики; см. гл. 4). Количество разрушенного антибиотика является функцией концентрации фермента в питательной среде и, следовательно, зависит от величины инокулума.
На первый взгляд кажется, что, если плотность культуры бактерий одинакова, не важно, исследуется ли активность антибиотика в маленьких объемах, например 0,25 мл и меньше в миниатюризованных системах, или в объеме 10 мл в обычных лабораторных пробирках. Если все бактерии в популяции идентичны, никакой разницы в результатах не будет.
Когда общее число бактерий в инокулуме очень велико, повышается вероятность того, что в среде будут присутствовать клетки, менее восприимчивые к антибиотику. Рост всех восприимчивых клеток будет подавлен, однако менее восприимчивые (в принципе это может быть даже единственная клетка) будут размножаться, и после инкубации в течение 18 ч образуется по-
Таблица 2.2. Факторы, влияющие на активность некоторых антибиотиков
пуляция бактерий с высокой плотностью. Значительная вариабельность величины МПК с изменением числа инокулирован- ных клеток обычно свидетельствует о высокой частоте мутантов, устойчивых к антибиотику (гл. 4). Частота появления устойчивых мутантов неодинакова для разных антибиотиков. В случае антибиотиков, используемых в клинике, она колеблется от 10~7 до 10-10.
В этом разделе описаны далеко не все факторы, которые могут влиять на активность антибиотика в отношении определенной бактерии (табл. 2.2). Поэтому, чтобы использовать подавление роста бактерий для количественного определения активности антибиотиков и получить данные, которые можно воспроизвести в разных лабораториях, необходимо, чтобы все условия были точно определены и по возможности стандартизованы.
7. Сущность понятий минимальная ингибирующая (подавляющая) концентрация и минимальная бактерицидная концентрация.
Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) – минимальная концентрация химиотерапевтического или антисептического вещества, вызывающаяПолное подавление заметного невооруженным глазомРоста данного микроорганизма на средах в стандартных условиях опыта.
Измеряется в мкг/мл или в ед. действия. Устанавливается посевом испытуемой культуры на плотные или жидкие среды, содержащие различные концентрации препарата.
Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) – минимальная концентрация химиотерапевтического или антисептического средства, вызывающаяПолную гибель бактерии в стандартных условиях опыта.
Измеряется в мкг/мл или ед. действия. Устанавливается посевом испытуемой культуры на плотные или жидкие питательные среды, содержащие различные концентрации препарата. Для отличия от МИК из стерильных зон или прозрачных пробирок делают высев на среды без препарата (появление роста указывает на статическое действие, отсутствие его – на цидное).
МБК и МИК используют в химиотерапии и антисептике для выбора эффективных для данного больного препаратов и доз.
8.Сущность понятий чувствительность и резистентность возбудителя, постантибиотический эффект.
Чувствительность возбудителя – отсутствие у него механизмов резистентности к ХС; при этом размножение возбудителя подавляется средней терапевтической дозой, превышающей минимальную ингибирующую концентрацию в 2-4 раза.
Резистентность возбудителя – наличие механизмов резистентности к ХС; рост возбудителя не подавляется концентрацией препарата, оказывающей токсический эффект in vivo.
Постантибиотический эффект - персистирующее ингибирование жизнедеятельности бактерий после их кратковременного контакта с антибактериальным препаратом.
9. Детерминанты избирательной токсичности химиотерапевтических средств.
1) ХС накапливаются в микробных клетках в концентрациях во много раз больших, чем в клетках млекопитающих
2) ХС действуют на структуры, которые имеются только в микробной клетке (клеточная стенка, ДНК-гираза II типа) и отсутствуют в клетке млекопитающих
3) ХС действуют на биохимические процессы, протекающие исключительно в микробных клетках и отсутствующие в клетках млекопитающих.
10. Сущность различия фармакодинамических и химиотерапевтических свойств.
1. Фармакодинамическая терапия оперирует на уровне архитектуры функциональных систем, ее эффекты, как правило, обратимы. Для химиотерапии же наиболее ценны агенты с максимально необратимым действией.
2. Фармакодинамические средства вызывают градуальный ответ системы организма, для химиотерапевтических средств наиболее желательные эффекты «все или ничего».
3. Химиотерапия имеет этиотропную стратегию, направленную на уничтожение возбудителя или на трансформированные клетки организма, а фармакодинамическая терапия может быть как этиотропной, так и патогенетической.
11. Основные принципы рациональной химиотерапии.
1. Возбудитель должен быть чувствителен к АБ
Правило «наилучшего предложения» - референтные таблицы с учетом региональных популяционных особенностей антибактериальной чувствительности.
2. АБ должен созадвать терапевтическую концентрацию в очаге.
3. Преимущественно адекватный режим дозирования в зависимости от:
ü возбудителя
ü динамики клинического течения инфекции
ü локализации инфекции
ü длительности и характера течения инфекции (острая, хроническая или бактерионосительство)
4. Оптимальная продолжительность противомикробной химиотерапии (пример: стрептококковый фарингит излечим за 10 сут, острый неосложеннный гонококковый уретрит за 1-3 дня, острый несоложненный цистит за 3 дня).
Для предупреждения побочных реакций, развития суперинфекции или резистентности продолжительность лечения должна соответствовать периоду эрадикации возбудителя.
5. Учет факторов пациента:
ü аллергоанамнез, иммунокомпетентность
ü функция печени и почек
ü переносимость АБ при пероральном приеме; комплаентность
ü тяжесть состояния
ü возраст, пол, наличие беременности или вскармливания ребенка, прием пероральных контрацептивов
ü побочные эффекты
6. Комбинированная антибиотикотерапия.
(МИК) - минимальная ингибирующая (подавляющая) концентрация - наименьшая концентрация антибиотика,которая подавляет видимый рост исследуемого микроорганизма in vitro (в бульонных или на агаровых питательных средах) в стандартных условиях постановки опыта и выражается в мкг/мл (мг/л) или ед/мл.
Минимальная бактерицидная концентрация (МБК)- наименьшая концентрация антибиотика, которая при исследовании in vitro вызывает гибель 99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определённого периода времени.
Чувствительный микроорганизм - штамм микроорганизма, который не имеет механизмов резистентности к данному препарату. Его его на питательной среде прекращается при использовании антибиотика в терапевтической дозе.
Умеренно-резистентный микроорганизм - штамм микроорганизма, рост которого на питательной среде прекращается только при использовании антибиотика в высшей дозе. Лечение инфекций, вызываемых умеренно-резистентными микроорганизмами, проводится при отсутствии альтернативных препаратов, высшей (максимальной терапевтической) дозой антибиотика.
Резистентный микроорганизм - штамм микроорганизма, который имеет механизмы резистентности к данному препарату. Его рост на питательной среде прекращается лишь при использовании очень высоких концентраций препарата, которые нельзя создать в организме из-за их высокой токсичности. При лечении инфекций, вызванных этим микроорганизмом, клинический эффект от терапии отсутствует даже при использовании высшей дозы антибиотика. При этом могут наблюдаться побочные действия антибиотика.
Показания к определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам:
1) определение чувствительности к новому антибиотику, рекомендуемому к применению;
2) периодический мониторинг антибиотикорезистентности в отдельных медицинских центрах и в различных географических регионах с целью наблюдения за распространием антибиотикорезистентности;
3) обоснование адекватной антибиотикотерапии у отдельных больных в случаях:
а) выделения микроорганизмов из первично стерильных жидкостей, органов и тканей человека;
б) при выделении микроорганизмов из первично нестерильных биотопов, оценке чувствительности должна предшествовать оценка клинической значимости выделенного микроорганизма;
в) инфекций, резистентных к препаратам эмпирической терапии;
г) уникальных инфекций и отсутствии опыта их терапии;
д) инфекций, требующих пролонгированной терапии (каждую неделю терапии проводят детекцию антибиотикорезистености, так как возможна смена возбудителей).
Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам нецелесообразно:
1) для представителей нормальной микрофлоры человека, при их выделении из естественных мест обитания;
2) для видов микроорганизмов, у которых не описано резистентных форм к тем или иным антибиотикам. Например, Streptococcus pyogenes чувствительны к пенициллину, поэтому проводить определение чувствительности к этим препаратам в повседневной практике нецелесообразно.
Оглавление темы "Методы определения чувствительности к антимикробным средствам. Побочные эффекты антибиотикотерапии.":Методы определения чувствительности к антимикробным средствам. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК). Метод серийных разведений в жидких средах.
Критериями активности того или иного препарата выступают минимальная ингибирующая концентрация (МИК ) - наименьшая концентрация препарата, тормозящая рост тест-культуры и минимальная бактерицидная концентрация (МБК ) - наименьшая концентрация препарата, вызывающая бактерицидный эффект.
Метод серийных разведений в жидких средах
Метод серийных разведений в жидких средах позволяет установить минимальную ингибирующую концентрацию (МИК ) и минимальную бактерицидную концентрацую (МБК ) препарата для выделенного возбудителя. Исследования можно выполнять в различных объёмах питательной среды (1-10 мл). Используют жидкие питательные среды, соответствующие пищевым потребностям возбудителя. В пробирках (обычно восьми) готовят серию двойных разведений препарата на питательной среде. Концентрацию уменьшают соответственно от 128 до 0,06 мкг/мл (базовая концентрация может варьировать в зависимости от активности препарата). Конечный объём среды в каждой пробирке составляет 1 мл. Контролем служит пробирка, содержащая чистую питательную среду. В каждую пробирку вносят по 0,05 мл физиологического раствора, содержащего 106/мл микробных клеток. Пробирки инкубируют 10-18 ч при 37 °С (или до появления бактериального роста в контрольной пробирке). По истечении указанного срока результаты учитывают по изменению оптической плотности среды визуально или нефелометрически. Также можно применять модифицированный метод, используя среду, дополненную глюкозой и индикатором. Рост микроорганизмов сопровождается изменением рН среды и, соответственно, окраски индикатора.
|
Наименование веществ |
Уровень порогового значения
|
|---|---|
|
Группа амфетаминов |
|
|
Амфетамин |
|
|
Метамфетамин |
|
|
Метилендиоксиамфетамин (МДА) |
|
|
Другие вещества амфетаминовой группы |
|
|
Группа опиатов |
|
|
Морфин |
|
|
Кодеин |
|
|
6-моноацетилморфин |
|
|
Группа бензодиазепинов |
|
|
Оксазепам |
|
|
Диазепам |
|
|
Нордиазепам |
|
|
Мидазолам |
|
|
Феназепам |
|
|
Другие вещества группы бензодиазепина |
|
|
Группа барбитуратов |
|
|
Барбамил |
|
|
Этаминал натрия |
|
|
Химические вещества других групп |
|
|
11-нор-Δ 9 -тетрагидроканнабиноловая кислота (основной метаболит Δ 9 -тетра-гидроканнабинола) |
|
|
Кокаин и его метаболиты |
|
|
Метадон и его метаболиты |
|
|
Пропоксифен и его метаболиты |
|
|
Бупренорфин и его метаболиты |
|
|
d-Лизергид (ЛСД, ЛСД-25) |
|
|
Фентанил и его метаболиты |
|
|
Метаквалон |
|
|
Фенциклидин |
|
Таблица 2 приложения к Порядку проведения медицинского освидетельствования на состояние опьянения (алкогольного, наркотического или иного токсического) , утвержденному приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации (проект), "Уровни пороговых значений содержания наркотических средств, психотропных веществ, иных химических веществ и их метаболитов, определяемые методами подтверждающего анализа ".
Примечание: уровень порогового значения – это минимальная концентрация вещества (его метаболита) в биологическом объекте, определяемая методами предварительного или подтверждающего анализа, при выявлении которой результат исследования считается положительным.
Фактически аналогичная таблица под названием "Уровни порогового значения для подтверждающих методов анализа при исследовании мочи " приведена в Центральной химико-токсикологическая лаборатория при кафедре аналитической и судебно-медицинской токсикологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова (ЦХТЛ ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова) Министерства здравоохранения Российской Федерации от 30 августа 2011 года № 179-25/12И, где, однако, кроме всего прочего указаны концентрации фенобарбитала (1" 000 нг/мл), других веществ из группы барбитуратов (100 нг/мл) и котинина (100 нг/мл). Согласно данному ЦХТЛ ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова, в соответствии с пунктом 2 приказа Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 27.01.2006 года № 40 "Об организации проведения химико-токсикологических исследований при аналитической диагностике наличия в организме человека алкоголя, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ", разработала и утвердила требования к проведению химико-токсикологических исследований при аналитической диагностике наличия в организме человека наркотических средств, психотропных и других токсических веществ".
В частности, согласно пункту 12 информационного письма при проведении медицинского освидетельствования водителей транспортных средств, тестировании учащихся, проведении химико-токсикологических исследований при обращении граждан и иных случаях, установленных законодательством, исследование жидкости ротовой полости (слюны) недопустимо, так как не позволяет достоверно установить факт наличия в организме человека наркотических средств, психотропных и других токсических веществ. Контролируемые вещества могут быть определены в жидкости ротовой полости (слюне) во временном интервале, не превышающем нескольких часов с момента употребления.
Требования к техническим средствам, применяемым с целью обнаружения наркотических средств, психотропных и иных токсических веществ (их метаболитов) в образцах мочи, при проведении предварительных химико-токсикологических исследованиях (приложение № 1 к Методическим рекомендациям: Правила проведения химико-токсикологических исследований на предмет наличия в организме обучающихся в общеобразовательных организациях и профессиональных образовательных организациях, а также образовательных организациях высшего образования в целях раннего выявления незаконного потребления наркотических средств и психотропных веществ наркотических средств, психотропных и иных токсических веществ (их метаболитов) / Разработчик: Ассоциация специалистов и организаций лабораторной службы «Федерация лабораторной медицины» под редакцией главного внештатного специалиста по аналитической и судебно-медицинской токсикологии Минздрава России, д.х.н., профессора Б.Н. Изотова и главного внештатного специалиста по клинической лабораторной диагностике Минздрава России, д.м.н., профессора А. Г. Кочетова // Москва, 2015)
|
Наименование групп веществ |
Концентрация (нг/мл) |
|---|---|
|
Опиаты (6 моноацетилморфин, морфин, кодеин, дезоморфин и др.) |
|
|
Каннабиноиды |
|
|
Фенилалкиламины (амфетамин, метамфетамин, мефедрон и др.) |
|
|
Метадон |
|
|
Бензодиазепины |
|
|
МДМА |
|
|
Кокаин |
|
|
Барбитураты |
|
|
Котинин |
|
|
Синтетические каннабиноиды |
|
|
Катиноны |
|
|
Этилглюкуронид |
Требования к техническим средствам, применяемым с целью обнаружения наркотических средств, психотропных и иных токсических веществ (их метаболитов) в образцах мочи, при проведении подтверждающих химико-токсикологических исследований (приложение № 2 к указанному выше источнику)
|
Наименование групп веществ |
Концентрация (нг/мл) |
|---|---|
|
Группа амфетамина |
|
|
Амфетамин |
|
|
Метамфетамин |
|
|
Метилендиоксиамфетамин (МДА) |
|
|
Метилендиоксиметамфетамин (МДМА) |
|
|
Другие вещества амфетаминовой группы |
|
|
Группа опиатов |
|
|
Морфин |
|
|
Кодеин |
|
|
6-моноацетилморфин |
|
|
Другие вещества опийной группы |
|
|
Группа бензодиазепина |
|
|
Оксазепам |
|
|
Диазепам |
|
|
Нордиазепам |
|
|
Мидазолам |
|
|
Феназепам |
|
|
Другие вещества группы бензодиазепина |
|
|
Группа барбитуратов |
|
|
Фенобарбитал |
1000 |
|
Барбамил |
|
|
Этаминал натрия |
|
|
Другие вещества группы барбитуратов |
|
|
Вещества других групп |
|
|
11-нор-Δ9-тетрагидроканнабиноловая кислота (основной метаболит Δ9-тетра-гидроканнабинола) |
|
|
Бензоилэкгонин (метаболит кокаина) |
|
|
Метадон |
|
|
Пропоксифен |
|
|
Бупренорфин |
|
|
ЛСД |
|
|
Фентанил |
|
|
Метаквалон |
|
|
Фенциклидин |
|
|
Котинин |
|
|
Синтетические каннабиноиды |
|
|
Катиноны |
|
|
Этилглюкуронид |
|
Вместе с тем, при осуществлении защиты по делам об административных правонарушениях по статьям 12.8 и 12.27 часть 3 КоАП РФ, а также по делам, предусматривающим уголовную ответственность при управлении транспортным средством в состоянии опьянения (статьи 264 и 264.1 УК РФ), не следует забывать, что административная ответственность наступает в случае наличия наркотических средств или психотропных веществ в организме человека вне зависимости от их концентрации в организме человека, в крови и в моче.
В силу изложенного выявление в рамках проведения наркологических экспертиз, химико-токсикологических исследований, судебно-химических исследований наркотических средств, психотропных и токсических веществ, и веществ, вызывающих опьянение, даже на уровне, так сказать, "предела обнаружения используемого метода" является основанием для привлечения водителя транспортного средства к административной или уголовной ответственности по соответствующим статьям Кодекса РФ об административных правонарушениях и/или Уголовного кодекса РФ.
Для информации - " "
