Aglutinační reakce (RA). Detailní aglutinační reakce (RA). Přibližná aglutinační reakce (RA). Přímé hemaglutinační reakce Rozlišujte mezi přímou a nepřímou aglutinační reakcí
č. 29 Aglutinační reakce. Komponenty, mechanismus, způsoby instalace. Aplikace.
Aglutinační reakce- jednoduchá reakce, při které protilátky vážou korpuskulární antigeny (bakterie, erytrocyty nebo jiné buňky, nerozpustné částice s na sobě adsorbovanými antigeny, ale i makromolekulární agregáty). Vyskytuje se v přítomnosti elektrolytů, například když se přidá izotonický roztok chloridu sodného.
Používají se různé varianty aglutinační reakce: extenzivní, indikativní, nepřímá atd. Aglutinační reakce se projevuje tvorbou vloček nebo sedimentu (buňky „slepené“ protilátkami se dvěma a více antigen-vazebnými centry - obr. 13.1). RA se používá pro:
1) stanovení protilátek v krevním séru pacientů, například s brucelózou (Wrightova, Heddelsonova reakce), břišním tyfem a paratyfem (Vidalova reakce) a dalšími infekčními chorobami;
2) určení patogenu, izolovaný od pacienta;
3) stanovení krevních skupin pomocí monoklonálních protilátek proti aloantigenům erytrocytů.
Stanovení protilátek u pacienta proveďte podrobnou aglutinační reakci: Diagnosticum (suspenze usmrcených mikrobů) se přidá k ředěním pacientova krevního séra a po několika hodinách inkubace při 37 °C je zaznamenáno nejvyšší ředění séra (sérový titr), při kterém došlo k aglutinaci, tj. k precipitátu vytvořený.
Povaha a rychlost aglutinace závisí na typu antigenu a protilátek. Příkladem jsou zvláštnosti interakce diagnostik (O- a H-antigenů) se specifickými protilátkami. K aglutinační reakci s O-diagnosticem (bakterie usmrcené teplem, zadržující termostabilní O-antigen) dochází ve formě jemnozrnné aglutinace. Aglutinační reakce s H-diagnosticum (bakterie usmrcené formaldehydem, zadržující termolabilní bičíkový H-antigen) je hrubá a probíhá rychleji. Pokud je nutné určit patogen izolovaný od pacienta, dát indikativní aglutinační reakce, pomocí diagnostických protilátek (aglutinační sérum), tj. provádí se sérotypizace patogenu. Na podložním sklíčku se provádí indikativní reakce. Čistá kultura patogenu izolovaná od pacienta se přidá ke kapce diagnostického aglutinačního séra v ředění 1:10 nebo 1:20. Poblíž je umístěna kontrola: místo séra se aplikuje kapka roztoku chloridu sodného. Když se v kapce se sérem a mikroby objeví vločkovitý sediment, provede se podrobná aglutinační reakce ve zkumavkách se zvyšujícím se ředěním aglutinačního séra, do které se přidají 2-3 kapky suspenze patogenu. Aglutinace je zohledněna množstvím sedimentu a stupněm čirosti kapaliny. Reakce je považována za pozitivní, pokud je pozorována aglutinace v ředění blízkém titru diagnostického séra. Současně se berou v úvahu kontroly: sérum naředěné izotonickým roztokem chloridu sodného by mělo být průhledné, suspenze mikrobů ve stejném roztoku by měla být rovnoměrně zakalená, bez sedimentu.
Různé příbuzné bakterie mohou být aglutinovány stejným diagnostickým aglutinačním sérem, které
ztěžuje jejich identifikaci. Proto používají adsorbovaná aglutinační séra ze kterých
zkříženě reagující protilátky adsorpcí na příbuzné bakterie. Protilátky jsou v takovém séru zachovány,
specifické pouze pro danou bakterii.
1.1. AGLUTINAČNÍ REAKCE (RA)
AGLUTINAČNÍ REAKCE (RA)
Díky své specifičnosti, snadnosti provedení a demonstrativnosti se aglutinační reakce rozšířila v mikrobiologické praxi pro diagnostiku mnoha infekční choroby.
Aglutinační reakce je založena na specifičnosti interakce protilátek (aglutininů) s celými mikrobiálními nebo jinými buňkami (aglutinogeny). V důsledku této interakce vznikají částice a aglomeráty, které se srážejí (aglutinují) ve formě vloček.
Aglutinační reakce může zahrnovat živé i usmrcené bakterie, spirochety, houby, prvoky, rickettsie, stejně jako červené krvinky a další buňky. Reakce probíhá ve dvou fázích: první (neviditelná) specifická, kombinace antigenu a protilátek, druhá (viditelná) nespecifická, lepení antigenů, tzn. tvorba aglutinátu.
Aglutinát se tvoří, když se jedno aktivní centrum divalentní protilátky spojí s determinantní skupinou antigenu. Aglutinační reakce, jako každá sérologická reakce, probíhá v přítomnosti elektrolytů.
Zevně má projev pozitivní aglutinační reakce dvojí charakter. U bičíkovitých mikrobů, které mají pouze somatický O2 antigen, se samotné mikrobiální buňky drží přímo pohromadě. Tato aglutinace se nazývá jemnozrnná. Dochází k němu do 18 22 hodin. proti
Bičíkatí mikrobi mají dva antigeny: somatický O2 antigen a bičíkový H2 antigen. Pokud jsou buňky slepeny bičíky, tvoří se velké, volné vločky a tato aglutinační reakce se nazývá hrubozrnná. Vyskytuje se během 2 4 hodin.
Aglutinační reakci lze provádět jak za účelem kvalitativního, tak i kvantifikace specifických protilátek v krevním séru pacienta a za účelem stanovení druhu izolovaného patogenu. proti
Aglutinační reakci lze provádět jak v rozšířené verzi, která umožňuje pracovat se sérem naředěným na diagnostický titr, tak ve verzi indikativní reakce, která v zásadě umožňuje detekovat specifické protilátky nebo určit druh patogen.
Při provádění podrobné aglutinační reakce se za účelem zjištění specifických protilátek v krevním séru subjektu odebere testovací sérum v ředění 1:50 nebo 1:100. To je způsobeno skutečností, že normální protilátky mohou být přítomny ve velmi vysokých koncentracích v celém nebo mírně zředěném séru a výsledky reakce pak mohou být nepřesné. Materiál testovaný v této verzi reakce je krev pacienta.
Krev se odebírá nalačno nebo ne dříve než 6 hodin po jídle (jinak mohou být v krevním séru kapičky tuku, které by bylo zakalené a nevhodné pro výzkum). Krevní sérum se pacientovi odebírá obvykle ve druhém týdnu onemocnění sterilním odběrem 3 × 4 ml krve z kubitální žíly (do této doby se koncentruje maximum specifických protilátek). Jako známý antigen se používá diagnostický prostředek připravený z usmrcených, ale nezničených mikrobiálních buněk specifického druhu se specifickou antigenní strukturou.
Při provádění podrobné aglutinační reakce za účelem stanovení druhu a typu patogenu je antigenem živý patogen izolovaný ze studovaného materiálu. Protilátky obsažené v imunitním diagnostickém séru jsou známé. proti
Imunitní diagnostické sérum se získává z krve očkovaného králíka. Po stanovení titru (maximálního ředění, při kterém jsou protilátky detekovány) se diagnostické sérum nalije do ampulí s přídavkem konzervační látky. Toto sérum se používá k identifikaci podle antigenní struktury izolovaného patogenu.
MOŽNOSTI AGLUTINAČNÍ REAKCE
Tyto reakce zahrnují antigeny ve formě částic (mikrobiálních buněk, červených krvinek a dalších korpuskulárních antigenů), které jsou slepeny dohromady protilátkami a vysrážejí se.
K provedení aglutinační reakce (RA) jsou zapotřebí tři složky: 1) antigen (aglutinogen); 2) protilátka (aglutinin) a 3) elektrolyt (izotonický roztok chloridu sodného).
ORIENTATIVNÍ (TALÍŘSKÁ) AGLUTINAČNÍ REAKCE (RA)
Indikativní nebo destička RA se umístí na podložní sklíčko při pokojové teplotě. K tomu použijte Pasteurovu pipetu k samostatné aplikaci kapky séra v ředění 1:10 1:20 a kontrolní kapky izotonického roztoku chloridu sodného na sklenici. Do obou bakteriologických smyček se zavedou kolonie nebo denní kultura bakterií (kapka diagnostica) a důkladně se promísí. Reakce jsou zohledněny vizuálně po několika minutách, někdy pomocí lupy (x5). Při pozitivní RA je zaznamenán výskyt velkých a malých vloček v kapce séra, při negativní RA zůstává sérum rovnoměrně zakalené.
NEPŘÍMÁ (PASIVNÍ) HEMAGLUTINAČNÍ REAKCE (RNGA, RPGA)
Reakce se provádí: 1) k detekci polysacharidů, proteinů, extraktů bakterií a dalších vysoce disperzních látek, rickettsie a virů, jejichž komplexy s aglutininy nelze u konvenční RA pozorovat, nebo 2) k detekci protilátek v séru pacientů proti tyto vysoce rozptýlené látky a nejmenší mikroorganismy.
Nepřímá neboli pasivní aglutinace je chápána jako reakce, při které protilátky interagují s antigeny předem adsorbovanými na inertních částicích (latex, celulóza, polystyren, oxid barnatý aj. nebo ovčí červené krvinky, lidská krevní skupina I(0)).
Při pasivní hemaglutinační reakci (RPHA) se jako nosič používají červené krvinky. Antigenem nabité červené krvinky se slepí pohromadě v přítomnosti specifických protilátek proti tomuto antigenu a vysrážejí se. Antigenem senzibilizované erytrocyty se v RPGA používají jako erytrocytární diagnosticum pro průkaz protilátek (serodiagnostika). Pokud jsou červené krvinky nabity protilátkami (erytrocytární protilátka diagnosticum), lze jej použít k detekci antigenů.
Inscenace. V jamkách polystyrénových destiček se připraví série sériových ředění séra. Do předposlední jamky přidejte 0,5 ml zjevně pozitivního séra a do poslední jamky 0,5 ml fyziologického roztoku (kontroly). Poté přidejte 0,1 ml zředěného erytrocytárního diagnosticum do všech jamek, protřepejte a vložte na 2 hodiny do termostatu.
Účetnictví. V pozitivním případě se červené krvinky usazují na dně jamky ve formě rovnoměrné vrstvy buněk se složeným nebo zubatým okrajem (obrácený deštník), v negativním případě se usazují ve formě knoflíku nebo kroužku. .
1.2. NEUTRALIZAČNÍ REAKCE. LYSIS,
OPSONOFAGOCYTICKÁ REAKCE, REAKCE PŘECENITELNOSTI
REAKCE NEUTRALIZACE EXOTOXINU ANTITOXINEM (RN)
Reakce je založena na schopnosti antitoxického séra neutralizovat účinek exotoxinu. Používá se pro titraci antitoxických sér a stanovení exotoxinu.
Při titraci séra se k různým ředěním antitoxického séra přidává určitá dávka odpovídajícího toxinu. Když je antigen zcela neutralizován a nejsou zde žádné nespotřebované protilátky, dochází k počáteční flokulaci. Vločkovací reakci lze využít nejen k titraci séra (například záškrtu), ale také k titraci toxinu a toxoidu. Reakce neutralizace toxinu antitoxinem má velký praktický význam jako způsob stanovení aktivity antitoxických terapeutických sér. Antigen v této reakci je skutečný exotoxin.
Síla antitoxického séra je určena konvenčními jednotkami AE.
1 AE botulotoxinového séra jeho množství neutralizuje 1000 DLM botulotoxinu. Neutralizační reakci k určení druhu nebo typu exotoxinu (pro diagnostiku tetanu, botulismu, záškrtu atd.) lze provést in vitro (podle Ramona) a při stanovení toxigenity mikrobiálních buněk - v gelu ( podle Ouchterlonyho).
Lytická reakce (RL)
Jednou z ochranných vlastností imunitního séra je jeho schopnost rozpouštět mikroby nebo buněčné prvky vstupující do těla.
Specifické protilátky, které způsobují rozpouštění buněk (lýzu), se nazývají lysiny. V závislosti na povaze antigenu to mohou být bakteriolysiny, cytolysiny, spirochetolysiny, hemolyziny atd.
Lysiny projevují svůj účinek pouze v přítomnosti dalšího komplementového faktoru. Komplement, jako faktor nespecifické humorální imunity, se nachází téměř ve všech tělesných tekutinách, kromě mozkomíšního moku a tekutina přední komory oka. V lidském krevním séru byl zaznamenán poměrně vysoký a konstantní obsah komplementu a v krevním séru je ho hodně morče. U jiných savců je obsah komplementu v krevním séru odlišný.
Komplement je komplexní systém syrovátkových proteinů. Je nestabilní a kolabuje při 55 stupních po dobu 30 minut. Při pokojové teplotě je komplement zničen během dvou hodin. Velmi citlivý na dlouhodobé protřepávání, kyseliny a ultrafialové paprsky. Komplement je však skladován po dlouhou dobu (až šest měsíců) v sušeném stavu při nízkých teplotách. Komplement podporuje lýzu mikrobiálních buněk a červených krvinek.
Rozlišují se reakce bakteriolýzy a hemolýzy.
Podstatou bakteriolýzní reakce je, že když se specifické imunitní sérum spojí s odpovídajícími homologními živými mikrobiálními buňkami v přítomnosti komplementu, dojde k mikrobiální lýze.
Hemolytická reakce spočívá v tom, že když jsou erytrocyty vystaveny specifickému séru, které je vůči nim imunní (hemolytické) v přítomnosti komplementu, je pozorováno rozpouštění erytrocytů, tzn. hemolýza.
Hemolytická reakce v laboratorní praxi slouží ke stanovení rozsahu komplementu a také k zohlednění výsledků diagnostických reakcí fixace komplementu. Titr komplementu je jeho nejmenší množství, které způsobí lýzu červených krvinek do 30 minut v hemolytickém systému v objemu 2,5 ml. Lyzační reakce, stejně jako všechny sérologické reakce, probíhá v přítomnosti elektrolytu.
REAKCE PŘECENITELNOSTI (ALERGICKÉ)
Některé formy antigenu mohou při opakovaném kontaktu s tělem vyvolat reakci, která je specifická svým základem, ale zahrnuje nespecifické buněčné a molekulární faktory akutní zánětlivé reakce. Existují dvě známé formy hypersenzitivity: hypersenzitivita okamžitého typu (IHT) a hypersenzitivita opožděného typu (DTH). První typ reakce nastává za účasti protilátek a reakce se vyvíjí nejpozději do 2 hodin po opakovaném kontaktu s alergenem. Druhý typ je realizován pomocí zánětlivých T buněk (Tgc) jako hlavních efektorů reakce, zajišťujících akumulaci makrofágů v oblasti zánětu, reakce se projevuje po 6-8 hodinách a později.
Rozvoji hypersenzitivní reakce předchází setkání s antigenem a vznik senzibilizace, tzn. výskyt protilátek, aktivně senzibilizovaných lymfocytů a pasivně senzibilizovaných cytofilních protilátek jiných leukocytů (makrofágy, granulocyty).
Hypersenzitivní reakce mají tři fáze vývoje: imunologické; patochemické; patofyziologické.
V první, specifické fázi, alergen interaguje s protilátkami a (nebo) senzibilizovanými buňkami. Ve druhé fázi se z aktivovaných buněk uvolňují biologicky aktivní látky. Uvolněné mediátory (histamin, serotonin, leukotrieny, bradykinin aj.) vyvolávají různé periferní účinky charakteristické pro odpovídající typ reakce třetí fáze.
Reakce přecitlivělostčtvrtý typ
Reakce tohoto typu jsou způsobeny patogenními mezibuněčnými interakcemi senzibilizovaných pomocných T-buněk, cytotoxických T-lymfocytů (T zabíječských buněk) a aktivovaných buněk mononukleárního fagocytárního systému, způsobených prodlouženou stimulací imunitního systému bakteriálními antigeny, ve kterých je přítomna tzv. relativní nedostatečnost imunitního systému organismu eliminovat bakteriální patogeny z vnitřního prostředí infekční onemocnění. Tyto hypersenzitivní reakce způsobují u pacientů s tuberkulózou tuberkulózní plicní dutiny, jejich kaseózní nekrózu a celkovou intoxikaci. Kožní granulomatóza u tuberkulózy a lepry z morfopatogenetického hlediska je z velké části složena z hypersenzitivních reakcí čtvrtého typu.
Nejznámějším příkladem čtvrtého typu hypersenzitivní reakce je Mantouxova reakce, která se rozvine v místě intradermální injekce tuberkulinu pacientovi, jehož tělo a systém jsou senzibilizovány na mykobakteriální antigeny. V důsledku reakce se vytvoří hustá hyperemická papule s nekrózou ve středu, která se objeví jen několik hodin (pomalu) po intradermální injekci tuberkulinu. Tvorba papule začíná výstupem z cévní řečiště do mezibuněčných prostor mononukleárních fagocytů cirkulující krve. Současně začíná emigrace polymorfonukleárních buněk z cévního řečiště. Poté infiltrace neutrofily odezní a infiltrát se začne skládat převážně z lymfocytů a mononukleárních fagocytů. Tím se liší od Mantouxovy reakce od Arthusovy reakce, při které se v místě léze hromadí převážně polymorfonukleární leukocyty.
U hypersenzitivních reakcí typu 4 vede dlouhodobá stimulace senzibilizovaných lymfocytů antigeny k patologické změny tkání k patologicky intenzivnímu a prodlouženému uvolňování cytokinů pomocnými T buňkami. Intenzivní uvolňování cytokinů v lokusech poškození tkáně způsobuje hyperaktivaci buněk tam umístěného systému mononukleárních fagocytů, z nichž mnohé v hyperaktivovaném stavu tvoří vlákna epiteloidních buněk a některé se vzájemně spojují a vytvářejí obří buňky. Makrofágy, na jejichž povrchu jsou vystaveny bakteriální a virové antigeny, mohou být zničeny prostřednictvím fungování Tkillerů (přirozených zabijáků).
Čtvrtý typ hypersenzitivní reakce je vyvolán rozpoznáním cizího bakteriálního antigenu pomocnými T buňkami, které jsou na něj senzibilizovány. Nezbytnou podmínkou pro rozpoznání je interakce induktorů s antigeny exponovanými na povrchu buněk prezentujících antigen po endocytóze a zpracování cizorodých imunogenů mononukleárními fagocyty. Další nutná podmínka expozice antigenů v kombinaci s molekulami I. třídy z hlavního histokompatibilního komplexu. Po rozpoznání antigenu senzibilizované pomocné buňky uvolňují cytokiny a zejména interleukin2, který aktivuje přirozené zabíječe a mononukleární fagocyty. Aktivované mononukleární fagocyty uvolňují proteolytické enzymy a volné kyslíkové radikály, které poškozují tkáň.
Kožní alergické testy jsou testy, které zjišťují senzibilizaci těla na alergeny, určují jeho infekci, například tuberkulózu, brucelózu, úroveň kolektivní imunity, například tularémii. Podle místa podání alergenu se rozlišují: 1) kožní testy; 2) skarifikace; 3) intradermální; 4) podkožní. Klinická reakce na alergen při kožním alergickém testu se dělí na lokální, celkovou a fokální, dále na okamžitou a opožděnou.
Místní reakce mediátor typu GNT se objeví po 520 minutách, jsou vyjádřeny ve formě erytému a puchýře, zmizí po několika hodinách, jsou hodnoceny metodou plus podle velikosti erytému, měřené v mm. Lokální reakce HRT se objevují během 24-48 hodin, trvají dlouho, objevují se ve formě infiltrátu, někdy s nekrózou ve středu, a hodnotí se podle velikosti infiltrátu v mm, také pomocí systému plus. U cytotoxických a imunokomplexních typů HNT jsou hyperémie a infiltrace pozorovány po 3-4 hodinách, maxima dosahují po 6-8 hodinách a odeznívají asi po dni. Někdy jsou pozorovány kombinované reakce.
1.3. REAKCE FIXACE DOPLŇKU (FFR)
Tato reakce se používá, když laboratorní výzkum pro detekci protilátek v krevním séru během různé infekce a také k identifikaci patogenu podle jeho antigenní struktury.
Reakce fixace komplementu je komplexní. sérologické reakce a má vysokou senzitivitu a specificitu.
Charakteristickým rysem této reakce je, že ke změně antigenu během jeho interakce se specifickými protilátkami dochází pouze v přítomnosti komplementu. Komplement je adsorbován pouze na komplexu „antigen protilátky“. Komplex „antigen protilátky“ se tvoří pouze v případě, že existuje afinita mezi antigenem a protilátkou v séru.
Adsorpce komplementu na komplex „antigenové protilátky“ může mít různé účinky na osud antigenu v závislosti na jeho vlastnostech.
Některé z antigenů za těchto podmínek podléhají prudkým morfologickým změnám, včetně rozpouštění (hemolýza, Isaev-Pfeifferův fenomén, cytolytické působení). Jiní mění rychlost pohybu (imobilizace treponému). Ještě další umírají bez náhlého ohrožení destruktivní změny(baktericidní nebo cytotoxický účinek). Konečně, adsorpce komplementu nemusí být doprovázena změnami antigenu, které jsou snadno pozorovatelné.
Podle mechanismu RSC probíhá ve dvou fázích:
- První fází je tvorba komplexu „antigenové protilátky“ a adsorpce na tento komplementový komplex. Výsledek fáze není vizuálně viditelný (interakce antigenu a protilátek s obligátní účastí komplementu).
- Druhou fází je změna antigenu pod vlivem specifických protilátek za přítomnosti komplementu. Výsledek fáze může být viditelný vizuálně nebo neviditelný (detekce výsledků reakce pomocí indikátorového hemolytického systému (ovčí červené krvinky a hemolytické sérum).
K destrukci červených krvinek hemolytickým sérem dochází pouze v případě, že je do hemolytického systému přidán komplement. Pokud byl komplement předtím adsorbován na komplex antigen-protilátka, pak nedochází k hemolýze erytrocytů.
Výsledek experimentu se hodnotí tak, že se zaznamená přítomnost nebo nepřítomnost hemolýzy ve všech zkumavkách. Reakce je považována za pozitivní, když je hemolýza úplně opožděna, když je kapalina ve zkumavce bezbarvá a červené krvinky se usazují na dně, negativní když je úplná lýza erytrocyty, kdy je tekutina intenzivně zbarvená („lak“ krev). Stupeň zpoždění hemolýzy se posuzuje v závislosti na intenzitě barvy kapaliny a velikosti sedimentu červených krvinek na dně (++++, +++, ++, +).
V případě, že změny v antigenu zůstávají nepřístupné pro vizuální pozorování, je nutné použít druhý systém, který funguje jako indikátor, umožňující posoudit stav komplementu a vyvodit závěr o výsledku reakce.
Tento indikátorový systém představují složky hemolytické reakce, která zahrnuje ovčí erytrocyty a hemolytické sérum, které obsahuje specifické protilátky proti erytrocytům (hemolyziny), ale neobsahuje komplement. Tento indikátorový systém se přidá do zkumavek hodinu po umístění hlavního RSC. Pokud je reakce fixace komplementu pozitivní, pak se vytvoří komplex protilátka antigen, který na sebe adsorbuje komplement. Vzhledem k tomu, že komplement se používá v množství nezbytném pouze pro jednu reakci a k lýze erytrocytů může dojít pouze v přítomnosti komplementu, pak, když je adsorbován na komplex „antigenové protilátky“, dojde k lýze erytrocytů v hemolytickém (indikátorovém) systému. nenastane. Pokud je reakce fixace komplementu negativní, komplex „antigenová protilátka“ se nevytváří, komplement zůstává volný a po přidání hemolytického systému dochází k lýze erytrocytů.
1.4. DNA SONDY. POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR),
IMUNOENZYMOVÁ METODA (ELISA), FLUORESCENČNÍ PROTILÁTKOVÁ METODA (FFA)
METODY GENOVÉHO SNÍMANÍ
Intenzivní rozvoj molekulární biologie a vytvoření dokonalé metodologické základny pro genetický výzkum vytvořily základ genetického inženýrství. V oblasti diagnostiky vznikl a rychle se rozvíjí směr ke stanovení specifických nukleotidových sekvencí DNA a RNA, tzv. genové sondování. Tyto techniky jsou založeny na schopnosti nukleových kyselin hybridizovat a vytvářet dvouvláknové struktury díky interakci komplementárních nukleotidů (AT, GC).
Pro stanovení požadované sekvence DNA (neboli RNA) je speciálně vytvořena tzv. polynukleotidová sonda se specifickou sekvencí bází. Do jeho složení je zavedena speciální značka, která umožňuje identifikovat tvorbu komplexu.
Přestože genové sondování nelze zařadit mezi metody imunochemické analýzy, její základní princip (interakce komplementárních struktur) je metodicky implementován stejně jako indikátorové metody imunodiagnostiky. Metody genového sondování navíc umožňují doplnit informace o infekčním agens v nepřítomnosti jeho fenotypové exprese (viry zabudované v genomu, „tiché“ geny).
Pro provedení analýzy DNA se vzorek denaturuje, aby se získaly jednovláknové struktury, se kterými reagují molekuly sondy DNA nebo RNA. K přípravě sond se používají buď různé úseky DNA (nebo RNA) izolované z přírodního zdroje (například konkrétního mikroorganismu), obvykle prezentované ve formě genetických sekvencí ve vektorových plazmidech, nebo chemicky syntetizované oligonukleotidy. V některých případech se jako sonda používají preparáty genomové DNA hydrolyzované na fragmenty, někdy preparáty RNA a zvláště často ribozomální RNA. Jako označení se používají stejné indikátory jako pro různé typy imunochemická analýza: radioaktivní izotopy, fluoresceiny, biotop (s dalším projevem enzymovým komplexem avidinu) atd.
Pořadí analýzy je určeno vlastnostmi dostupné sondy
V současné době se stále více používají komerční sady obsahující všechny potřebné přísady.
Ve většině případů lze postup analýzy rozdělit do následujících fází: příprava vzorku (včetně extrakce a denaturace DNA), fixace vzorku na nosič (nejčastěji polymerní membránový filtr), prehybridizace, samotná hybridizace, promytí nenavázaných produktů, detekce . V nepřítomnosti standardního preparátu DNA nebo RNAprobe se nejprve získá a označí.
K přípravě vzorku může být nutné předběžně „vypěstovat“ testovaný materiál, aby se identifikovaly jednotlivé kolonie bakterií nebo se zvýšila koncentrace virů v buněčné kultuře. Provádí se také přímá analýza vzorků krevního séra, moči, krvinek nebo plné krve na přítomnost infekčního agens. K uvolnění nukleových kyselin z buněčných struktur se provádí buněčná lýza a v některých případech se preparát DNA čistí pomocí fenolu.
Při ošetření alkálií dochází k denaturaci DNA, tedy k jejímu přechodu na jednovláknovou formu. Vzorek nukleové kyseliny je poté fixován na nosič, nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu, obvykle inkubací po dobu 10 minut až 4 hodin při 80 °C ve vakuu. Dále je v procesu prehybridizace dosaženo inaktivace volných vazebných míst, aby se snížila nespecifická interakce sondy s membránou. Proces hybridizace trvá od 2 do 20 hodin v závislosti na koncentraci DNA ve vzorku, koncentraci použité sondy a její velikosti.
Po dokončení hybridizace a vymytí nenavázaných produktů je detekován vytvořený komplex. Pokud sonda obsahuje radioaktivní značku, pak se k prokázání reakce membrána exponuje na fotografický film (autoradiografie). Pro ostatní štítky se používají odpovídající postupy.
Nejslibnější je pořízení neradioaktivních (tzv. studených) sond. Na stejném základě se vyvíjí hybridizační technika, která umožňuje prokázat přítomnost patogenu v preparátech řezů a punkcích tkání, což je důležité zejména při patomorfologické analýze (hybridizace in situ).
Významnou etapou ve vývoji metod genového sondování bylo použití polymerázová reakce amplifikace (PCR). Tento přístup umožňuje zvýšit koncentraci specifické (předem známé) sekvence DNA ve vzorku syntézou více kopií in vitro. K provedení reakce se do zkoumaného vzorku DNA přidá enzymový preparát DNA polymerázy, přebytek deoxynukleotidů pro syntézu a tzv. primery - dva typy oligonukleotidů o velikosti 2025 bází odpovídajících koncovým úsekům DNA. DNA sekvence zájmu. Jeden z primerů by měl být kopií začátku čtecí oblasti kódujícího řetězce DNA ve směru čtení 53 a druhý by měl být kopií opačného konce nekódujícího řetězce. Poté se s každým cyklem polymerázové reakce počet kopií DNA zdvojnásobí.
K dosažení navázání primeru je nutná denaturace DNA (tání) při 94 °C, následovaná zahřátím směsi na 40-55 °C.
K provedení reakce byly navrženy programovatelné inkubátory pro mikrovzorky, které snadno střídají změny optimální teploty pro každý stupeň reakce.
Amplifikační reakce může významně zvýšit citlivost analýzy během genového sondování, což je zvláště důležité při nízkých koncentracích infekčního agens.
Jednou z významných výhod genového sondování s amplifikací je možnost studovat submikroskopická množství patologického materiálu.
Dalším rysem metody, důležitějším pro analýzu infekčního materiálu, je schopnost identifikovat skryté (tiché) geny. Metody spojené s využitím genového sondování budou jistě šířeji zaváděny do praxe diagnostiky infekčních onemocnění, protože budou jednodušší a levnější.
Metody ELISA a RIF jsou převážně kvalitativní nebo semikvantitativní povahy. Při velmi nízkých koncentracích složek nelze tvorbu komplexu antigen protilátky detekovat ani vizuálně, ani pomocí jednoduchých instrumentálních prostředků. Indikaci komplexu antigen-protilátka lze v takových případech provést, je-li do jedné z výchozích složek antigen nebo protilátka zavedena značka, kterou lze snadno detekovat v koncentracích srovnatelných se stanovenou koncentrací analytu.
Jako značky lze použít radioaktivní izotopy (například 125I), fluorescenční látky a enzymy.
V závislosti na použitém značení existují metody analýzy radioimunitní (RIA), fluorescenční imunitní (FIA), enzymatické imunoanalýzy (ELISA) atd. minulé rokyširoký praktické využití obdrželi ELISA, což je spojeno s možností kvantitativního stanovení, vysokou senzitivitou, specificitou a automatizací účtování.
Enzymové imunoanalytické metody jsou skupinou metod, které umožňují detekci komplexu antigen-protilátka pomocí substrátu, který je štěpen enzymem a vytváří barvu.
Podstatou metody je spojení složek reakce antigenní protilátky s naměřenou enzymatickou značkou. Antigen nebo protilátka, která reaguje, je značena enzymem. Na základě transformace substrátu působením enzymu lze posoudit množství interagující složky reakce antigen-protilátka. Enzym v tomto případě slouží jako marker imunitní reakce a umožňuje ji pozorovat vizuálně nebo instrumentálně.
Enzymy jsou velmi vhodné značky, protože jejich katalytické vlastnosti jim umožňují působit jako zesilovače, protože jedna molekula enzymu může podpořit tvorbu více než 1 × 105 molekul produktu katalytické reakce za minutu. Je nutné vybrat enzym, který si dlouho zachovává svou katalytickou aktivitu, neztrácí ji při vazbě na antigen nebo protilátku a má vysokou specificitu vůči substrátu.
Hlavní metody produkce enzymaticky značených protilátek nebo antigenů a konjugátů jsou: chemické, imunologické a genetické inženýrství. Nejčastěji používané enzymy pro ELISA jsou křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza, galaktosidáza atd.
K detekci enzymové aktivity v komplexu antigen-protilátka za účelem vizuálního a přístrojového záznamu reakce se používají chromogenní substráty, jejichž roztoky, zpočátku bezbarvé, během enzymatické reakce získávají barvu, jejíž intenzita je úměrná množství enzymu. Pro detekci aktivity křenové peroxidázy v ELISA na pevné fázi se tedy jako substrát používá kyselina 5-aminosalicylová, která vytváří intenzivní hnědé zbarvení, a ortho-fenylendiamin, který vytváří oranžovo-žluté zbarvení. K detekci aktivity alkalická fosfatáza a β-galatosidázy používají nitrofenylfosfáty a nitrofenylgalaktosidy, v daném pořadí.
Výsledek reakce při vzniku barevného produktu se stanoví vizuálně nebo pomocí spektrofotometru, který měří absorpci světla o určité vlnové délce.
Existuje mnoho možností pro provedení ELISA. Existují homogenní a heterogenní možnosti.
Podle způsobu výroby se rozlišují kompetitivní a nekompetitivní metody ELISA. Pokud je v první fázi v systému přítomna pouze analyzovaná sloučenina a její odpovídající vazebná centra (antigen a specifické protilátky), pak je metoda nekompetitivní. Pokud jsou v první fázi přítomny analyzovaná sloučenina (antigen) a její analog (enzymem značený antigen), které spolu soutěží o vazbu na specifická vazebná centra (protilátky), kterých je nedostatek, pak je metoda kompetitivní. V tomto případě platí, že čím více testovaného antigenu roztok obsahuje, tím menší je počet navázaných značených antigenů.
METODA FLUORESCENČNÍCH PROTILÁTEK (MFA) nebo IMUNOFLUORESCENČNÍ REAKCE (RIF)
Imunofluorescenční metoda je metodou volby pro rychlou detekci a identifikaci neznámého mikroorganismu v testovaném materiálu.
Ag + AT + elektrolyt = komplex zářící v UV záření
Mikrobové sérum označené fluorochromem
Často používaným barvivem je fluorescein isothiokyanát FITC
Při studiu této metody se používá fluorescenční mikroskop.
Inscenace RIF
Na nátěr se nanese 30 μl roztoku protilátky značené FITC.
Umístěte sklenici do vlhké komory a udržujte ji při pokojové teplotě po dobu 20-25 minut, nebo v termostatu při 37°C po dobu 15 minut.
Umyjte sklo v běžícím stroji voda z vodovodu 2 minuty, opláchněte destilovanou vodou a osušte na vzduchu.
Na vysušený nátěr se nanese kapka montážní kapaliny, nátěr se překryje krycím sklíčkem a mikroskopuje se pomocí fluorescenčního mikroskopu nebo fluorescenčního nástavce na klasický optický mikroskop.
/ 50
Nejhorší Nejlepší
Tyto reakce zahrnují antigeny ve formě částic (mikrobiálních buněk, červených krvinek a dalších korpuskulárních antigenů), které jsou slepeny dohromady protilátkami a vysrážejí se.
Podle typu použitého imunodiagnostika se rozlišují reakce mikrobiální aglutinace, hemaglutinace, latexové aglutinace, koagulace atd.
Pro diagnostiku infekčních onemocnění se aglutinační reakce provádí dvěma směry: pomocí diagnostického aglutinačního séra (sérologická identifikace mikroba) se určí typ patogenního mikroba izolovaného od pacienta a pomocí standardního mikrobiálního séra se detekují specifické protilátky v séru pacienta. diagnosticum (sérodiagnostika onemocnění, sérologická diagnóza).
Existují rovné čáry a nepřímá reakce aglutinace
Přímá mikrobiální aglutinační reakce (RA). Při této reakci protilátky (aglutininy) přímo aglutinují korpuskulární antigeny (aglutanogeny). Obvykle jsou představovány suspenzí inaktivovaných mikroorganismů (mikrobiální aglutinační reakce). Na základě povahy vytvořeného aglutinátu se rozlišuje granulární a flokulentní aglutinace. Ke granulární aglutinaci dochází, když se mikroby obsahující O-antigen slepí. Bakterie s bičíky (H-antigen) aglutinují za vzniku velkých vloček.
K určení typu mikroorganismů se používají standardní diagnostická aglutinační séra. Získávají se hyperimunizací laboratorních zvířat suspenzí bakterií. Titr takového séra je jeho nejvyšším ředěním, při kterém je pozorována jasná aglutinace odpovídajícího antigenu. Vzhledem ke složitosti antigenní struktury bakterií však aglutinační séra obsahují protilátky nejen proti druhově specifickým, ale i proti skupinovým antigenům a mohou způsobit skupinovou aglutinaci s příbuznými druhy bakterií. Titry protilátek vůči druhově specifickým antigenům v séru jsou vždy vyšší než vůči skupinovým antigenům. K odstranění skupinově specifických protilátek se do séra postupně přidávají mikroorganismy obsahující skupinové antigeny (metoda Castellani). Tato metoda produkuje adsorbovaná séra, která obsahují protilátky proti určitý typ mikrob
Metody aglutinační reakce. Nejběžnější jsou lamelární (přibližné) a rozšířené RA. Deska RA je umístěna na skle. Při této reakci se používají mírně naředěná nebo neředěná séra. Používá se jako zrychlená metoda pro detekci protilátek nebo identifikaci mikroorganismů. Na sklenici se nanese kapka séra, do které se kličkou zavede neznámá bakteriální kultura, promíchá se a po 2-3 minutách je pozorován vzhled jemnozrnné nebo vločkovité aglutinace. Pro kontrolu se používá kapka fyziologického roztoku, u kterého je po přidání bakterií pozorován zákal. Při použití neadsorbovaných sér je reakce na skle pouze orientační.
Expandovaná RA se provádí ve zkumavkách nebo destičkách. V tomto případě se diagnostické sérum naředí na titr a přidá se stejná množství antigenu. Na pozitivní výsledek Na dně zkumavky se vytvoří sypký sediment ve formě „deštníku“, při negativním se vytvoří sediment ve formě „knoflíku“. Protože titry skupinově specifických protilátek v séru jsou mnohem nižší než titry druhově specifických protilátek, jsou skupinové reakce pozorovány pouze v malých ředěních séra. Pokud dojde k aglutinaci před titrem nebo do poloviny titru séra, je to druhově specifické.
Pro stanovení protilátek v séru pacienta (sérologická diagnostika) se používá standardní mikrobiální diagnosticum obsahující suspenzi známých mikrobů nebo jejich antigenů. V tomto případě je také možné instalovat desku a nasazenou RA.
Přímá aglutinační reakce buněk. Pro stanovení krevních skupin se používají standardní krevní séra dárců obsahující známé protilátky anti-A nebo anti-B. Reakce se provádějí na skle nebo deskách. Pokud mají erytrocyty A (2. krevní skupina), B (3. krevní skupina) nebo oba antigeny (4. krevní skupina), příslušná séra aglutinují erytrocyty. Používá se také test krevní kompatibility, kdy se smíchají kapky krve od dárce a příjemce a posoudí se aglutinace.
Kliniky využívají aglutinační reakci leukocytů, krevních destiček a dalších buněk k identifikaci autoprotilátek a také ke stanovení antigenů na těchto buňkách.
Nepřímá (pasivní) aglutinační reakce. Pro získání fenoménu aglutinace je antigen předem adsorbován na korpuskulárním nosiči, kterým jsou inertní částice (latex, celulóza, polystyren, oxid barnatý atd.) nebo buňky (ovčí červené krvinky, lidská krevní skupina I(0) ).
Při pasivní hemaglutinační reakci (RPHA) se jako nosič používají červené krvinky. Antigenem nabité červené krvinky se slepí pohromadě v přítomnosti specifických protilátek proti tomuto antigenu a vysrážejí se. Antigenem senzibilizované erytrocyty se v RPGA používají jako erytrocytární antigenní diagnosticum pro průkaz protilátek (sérodiagnostika, sérologická diagnostika). Pokud jsou červené krvinky naplněny protilátkami, mohou být použity k detekci antigenů.
Přímé a nepřímé antiimunoglobulinové Coombsovy reakce. Používá se k detekci „nekompletních“ (neaglutinujících) protilátek, které se tvoří při různé nemoci: Rhesusův konflikt, autoimunitní onemocnění, některé infekce. K vyvolání těchto reakcí je zapotřebí antiglobulinové sérum, které se získá imunizací králíka lidskými imunoglobuliny. Toto sérum obsahuje kompletní (bivalentní) anti-imunoglobulinové protilátky.
Přímá reakce: k promytým erytrocytům z krve pacienta se přidá antiimunoglobulinové sérum. Pokud jsou na červených krvinkách neúplné protilátky (imunoglobuliny), což je pozorováno s hemolytická anémie, Rhesus konflikt (fetální červené krvinky), pak dochází k jejich aglutinaci.
Nepřímá reakce odhalí volné antierytrocytární protilátky v krevním séru pacienta. K tomuto séru se přidají promyté erytrocyty od dárce krevní skupiny 0(I). Směs se inkubuje při 37 °C po dobu 30 minut a červené krvinky se promyjí. Poté se k nim přidá antiimunoglobulinové sérum. Pokud sérum pacienta mělo nekompletní protilátky proti erytrocytům, dojde k aglutinaci.
Aglutinace je slepení bakterií v důsledku interakce specifických AT s nimi. K provedení RA jsou zapotřebí tři složky: 1) AG (aglutinogen); 2) AT (aglutinin); 3) roztok elektrolytu (izotonický roztok chloridu sodného). Aglutinační reakce se účastní pouze korpuskulární antigeny (bakterie, červené krvinky, latexové částice s antigenem).
Aglutinační reakce na skle. Na podložní sklíčko bez tuku se pipetou nanese kapka diagnostického séra (ředění séra 1:10 - 1:20). Pomocí bakteriologické kličky se z povrchu šikmého agaru odebere čistá kultura zkoumaného mikroorganismu, přenese se do kapky séra a promíchá. Výsledek reakce se vezme v úvahu pouhým okem po 3-5 minutách. Pokud je reakce pozitivní, objeví se v kapce séra vzhled vloček (velkých nebo malých), které jsou po protřepání sklíčka jasně viditelné na tmavém pozadí. V případě negativní reakce zůstává kapalina rovnoměrně zakalená.
Aglutinační reakce ve zkumavkách. Do řady zkumavek se přidá 1 ml fyziologického roztoku. Do první zkumavky se přidá stejný objem testovaného krevního séra. Připraví se sériová dvojnásobná ředění séra (titrace séra), načež se do každé zkumavky přidají 2 kapky suspenze inaktivovaných bakterií (diagnosticum). Zkumavky se umístí na 2 hodiny do termostatu při 37 °C. Reakce probíhá za vzniku malých vloček, pouhým okem neviditelných, proto jsou výsledky zaznamenávány pod mírným zvětšením ve speciálním přístroji - aglutinoskopu. Intenzita aglutinace se bere v úvahu podle systému „čtyři plus“: úplná aglutinace - 4+, částečná aglutinace - 3+ nebo 2+, sporný výsledek - +. Poslední ředění, ve kterém je pozorována aglutinace 2+, se bere jako titr protilátek v testovaném séru.
Aglutinační reakce ve zkumavkách (rozsáhlá aglutinační reakce) se provádí za účelem stanovení titru protilátek proti původcům břišního tyfu a paratyfu (Vidalova reakce), brucelózy (Wrightova reakce) a tyfu (Weiglova reakce).
Aglutinace (z lat. aglutinatio - lepení) je lepení (spojování) korpuskulárních částic nesoucích antigen (celé buňky, latexové částice apod.) s molekulami specifických protilátek za přítomnosti elektrolytů, které končí tvorbou vloček nebo sedimentu. (aglutinovat) viditelné pouhým okem. Povaha sedimentu závisí na povaze antigenu: bičíkaté bakterie produkují hrubý vločkovitý sediment, bičíkovité a nekapsulární bakterie produkují jemnozrnný sediment a kapsulární bakterie produkují vláknitý sediment. Rozlišuje se přímá aglutinace, kdy se na interakci se specifickými protilátkami přímo podílejí vlastní antigeny bakteriální nebo jakékoli jiné buňky, např. erytrocytů; a nepřímé nebo pasivní, ve kterých bakteriální buňky nebo erytrocyty nebo latexové částice nejsou vlastními nosiči, ale cizími antigeny (nebo protilátkami), které jsou na nich sorbovány, aby se identifikovaly protilátky (nebo antigeny) pro ně specifické. Aglutinační reakce zahrnuje hlavně protilátky související s třídy IgG a IgM. Probíhá ve dvou fázích: zaprvé dochází ke specifické interakci mezi aktivním centrem protilátek a determinantou antigenu, tato fáze může nastat v nepřítomnosti elektrolytů a není provázena viditelnými změnami v reagujícím systému. Pro druhou fázi - tvorbu aglutinátu - je nutná přítomnost elektrolytů, které snižují elektrický náboj komplexů antigen + protilátka a urychlují proces jejich lepení. Tato fáze končí tvorbou aglutinátu.
Aglutinační reakce se provádějí buď na skleněných nebo hladkých kartonových deskách, nebo ve sterilních aglutinačních zkumavkách. Aglutinační reakce (přímé a pasivní) na skle se obvykle používají jako zrychlená metoda pro detekci specifických protilátek v séru pacienta (například s brucelózou) nebo pro sérologickou identifikaci patogenu. V druhém případě se obvykle používají dobře purifikovaná (adsorbovaná) diagnostická séra obsahující pouze monoreceptorové protilátky nebo jejich sadu na různé antigeny. Nespornou výhodou aglutinační reakce na skle je jednoduchost její realizace a skutečnost, že trvá několik minut nebo dokonce sekund, protože obě složky jsou použity v koncentrované formě. Má však pouze kvalitativní hodnotu a je méně citlivý než zkumavka. Rozsáhlá aglutinační reakce ve zkumavkách poskytuje přesnější výsledky, protože umožňuje stanovit kvantitativní obsah protilátek v séru (stanovit jeho titr) a v případě potřeby zaregistrovat skutečnost zvýšení titru protilátek, což má diagnostickou hodnotu . K nastavení reakce se přidá sérum naředěné určitým způsobem 0,85% roztokem NaCl a stejný objem (obvykle 0,5 ml) suspenze standardního diagnostika (nebo testovací kultury) obsahující 1 miliardu bakterií v 1 ml. aglutinační trubice. Výsledky aglutinační reakce se zaznamenávají nejprve po 2 hodinách inkubace zkumavek při 37 °C a nakonec po 20-24 hodinách podle dvou kritérií: přítomnost a velikost precipitátu a stupeň průhlednosti kapaliny nad usazeninou. Hodnocení se provádí systémem čtyř křížů. Reakce je nezbytně doprovázena kontrolou séra a antigenu. V případech, kdy se provádí podrobná aglutinační reakce ve zkumavce za účelem sérologické identifikace patogena, má diagnostickou hodnotu, pokud je reakce hodnocena jako pozitivní při naředění diagnostického séra alespoň na polovinu jeho titru.
Je třeba vzít v úvahu, že při míchání roztoků homologních antigenů a protilátek nejsou vždy pozorovány viditelné projevy aglutinační reakce. Sraženina se tvoří pouze při určitých optimálních poměrech obou reakčních složek. Mimo tyto limity není při významném přebytku antigenu nebo protilátek pozorována žádná reakce. Tento jev se nazývá „prozónový fenomén“. Je pozorován jak při aglutinační reakci, tak při srážecí reakci. Výskyt prozóny v imunitních reakcích se vysvětluje skutečností, že antigeny, které se na nich podílejí, jsou zpravidla polydeterminantní a molekuly IgG protilátky mají dvě aktivní centra. Při přebytku protilátek je povrch každé částice antigenu pokryt molekulami protilátky, takže nezůstávají žádné volné determinantní skupiny, takže druhé, nenavázané aktivní centrum protilátek nemůže interagovat s jinou částicí antigenu a vázat je na sebe. Tvoření viditelného aglutinátu nebo precipitátu je potlačeno i při nadbytku antigenu, kdy protilátek nezůstane jediné volné aktivní centrum, a proto se komplexy antigen + protilátka + antigen již nemohou zvětšovat.
Možnosti urychlených aglutinačních reakcí. Pasivní hemaglutinační reakce a její varianty
Klasická aglutinační reakce zahrnuje použití korpuskulárních antigenů. Mohou však být zahrnuty také rozpustné antigeny. Aby to bylo možné, jsou takové antigeny adsorbovány na imunologicky inertních částicích. Jako nosič lze použít částice latexu nebo bentonitu, v současnosti se však nejčastěji používají zvířecí nebo lidské erytrocyty, které zlepšují své adsorpční vlastnosti ošetřením roztoky taninu, formalínu nebo benzidinu. Červené krvinky, které na sebe adsorbovaly antigen, se nazývají senzibilizované tímto antigenem a imunitní reakce, na které se podílejí, se nazývá nepřímá nebo pasivní hemaglutinační reakce (IRHA nebo RPHA), protože červené krvinky se jí pasivně účastní.
RPGA je umístěn ve speciálních polystyrénových deskách s otvory s polokulovým dnem. Při jeho použití pro sérologickou diagnostiku se v těchto jamkách připraví dvojnásobné ředění testovaného séra ve fyziologickém roztoku a poté se do něj přidá suspenze senzibilizovaných erytrocytů jako diagnostické činidlo. Výsledky se zaznamenávají po 2 hodinách inkubace při 37 °C za použití systému čtyř křížů. Při pozitivní reakci se aglutinované červené krvinky usadí na dně jamky a rovnoměrně ji pokrývají ve formě obráceného deštníku. Pokud je reakce negativní, červené krvinky se také usadí, kapalina se vyjasní a sediment vypadá jako malý „kotouč“ uprostřed jamky. Sérový titr v RPHA je považován za jeho poslední ředění, které stále poskytuje výraznou hemaglutinaci bez výrazných známek přítomnosti „disku“.
RPGA lze také použít jako zrychlenou metodu bakteriologické diagnostiky k detekci přímo v testovaném materiálu neznámé bakterie, viry, toxiny, například patogeny moru, stafylokokové enterotoxiny atd. U této verze RPGA se erytrocyty, které se adsorbovaly, známé svými specificity se používají jako známá složka reakce protilátky - protilátka erythrocyte diagnosticum. Pokud testovaný materiál obsahuje dostatečné množství známého antigenu, bude RPGA pozitivní.
Možnosti použití RPHA jsou: reakce neutralizace antigenu (RNAg), reakce neutralizace protilátky (RNAb), reakce pasivní inhibice hemaglutinace (PHA). K těmto reakcím se využívá antigenní a protilátková erytrocytární diagnostika. Současně lze použít dvě vzájemně se ovládající jednosměrné reakce, např. RPHA s antigenním diagnostikem a RNAg s protilátkovým erytrocytárním diagnostikem.
Protilátková neutralizační reakce (RNAb) spočívá v smíchání suspenze obsahující požadovaný antigen se specifickým imunitním sérem obsahujícím známé protilátky ve vhodných objemech a inkubaci při 37 °C po dobu dvou hodin. Poté se přidá antigenní erytrocytární diagnosticum. Směs se protřepe a nechá se při teplotě místnosti. Výsledky se berou v úvahu po 3-4 hodinách a nakonec po 18-24 hodinách.Pokud testovaný materiál obsahuje antigen, naváže protilátky (neutralizuje je), a proto nedojde k hemaglutinaci.
Antigenneutralizační reakce (RNAg) se provádí na stejném principu. Pouze v tomto případě jsou v testovaném materiálu detekovány protilátky. Specifický antigen přidaný k takovému testovanému materiálu se naváže na protilátky v něm obsažené, tj. dojde k neutralizaci antigenu protilátkami, a proto při přidání protilátky pro diagnostiku erytrocytů nedojde k hemaglutinaci.
Koaglutinační reakce. Je to jedna z možností pasivní, tedy zrychlené aglutinační reakce na skle zprostředkované buňkami nesoucími protilátky. Tato reakce je založena na unikátní nemovitost Staphylococcus aureus, který ve své buněčné stěně obsahuje protein A, se váže na Fc fragmenty IgG a IgM. V tomto případě aktivní centra protilátek zůstávají volná a mohou interagovat se specifickými determinantami antigenů. Na podložní sklíčko se nanese kapka 2% suspenze stafylokoků senzibilizovaných vhodnými protilátkami a přidá se kapka suspenze studovaných bakterií. Pokud se antigen shoduje s protilátkami, dojde během 30-60 s k jasné aglutinaci stafylokoků nabitých protilátkami.
Latexová aglutinační reakce (LAR). Nosičem protilátek v tomto diagnostickém systému jsou malé standardní latexové částice. Reakce se provádí pomocí mikrometody v jamkách na skle. Hlavní podmínkou úspěšného stagingu PAH je důsledné dodržování kvantitativních poměrů složek systému: do 50 μl testovaného materiálu se přidá 10 μl latexového přípravku senzibilizovaného protilátkami. Specifičnost PAH je kontrolována pomocí tří kontrolních testů obsažených v komerčních testovacích systémech: známá pozitivní reakce, známá negativní reakce a kontrola kvality latexových suspenzí pomocí latexů nesenzibilizovaných PAH (neobsahujících protilátky) s testovaným materiálem. U nás se jako nosiče specifických protilátek používají polystyrenové monodisperzní latexy s různými průměry částic (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). LAG se používá pro rychlou detekci mikroorganismů nebo jejich antigenů v testovaném materiálu.
Imunomagnetická detekce antigenů. Jedna z možností zrychlené aglutinační reakce na skle je spojena s použitím supermagnetických polymerních částic potažených specifickými protilátkami. Jedna taková částice váže až 107-108 buněk mikroorganismů, díky čemuž je citlivost tato metoda dosahuje 5 CFU/ml. Imunomagnetickou detekci mikroorganismů lze použít v kombinaci s KPR.
Agregátní hemaglutinační reakce (AHA). Umožňuje rychle detekovat v krvi pacientů jak volně cirkulující antigeny (antigenemie), tak antigeny spojené s protilátkami – cirkulující imunitní komplexy (CIC). U RAHA se používají červené krvinky senzibilizované vhodnými protilátkami. Přídavek krevního séra pacienta, které obsahuje antigeny, k senzibilizovaným erytrocytům, na kterých jsou fixovány protilátky, vede ke slepení (aglutinaci) erytrocytů a imunitních komplexů.
Antiglobulinový Coombsův test (R. Coombsova reakce). Plné (divalentní) protilátky se stanoví pomocí přímých a pasivních aglutinačních reakcí. Nekompletní (monovalentní, blokující) protilátky se těmito metodami nedetekují, protože když se spojí s antigenem, blokují jej, ale nemohou způsobit agregaci antigenu do velkých konglomerátů. Neúplné (blokující) protilátky jsou takové, ve kterých funguje pouze jedno aktivní centrum; druhé aktivní centrum z neznámého důvodu nefunguje. K detekci nekompletních protilátek se používá speciální Coombsova reakce (obr. 72). Reakce zahrnuje: sérum pacienta, ve kterém jsou stanoveny neúplné protilátky, korpuskulární antigen-diagnostika, antiglobulinové sérum obsahující protilátky proti lidskému globulinu. Reakce probíhá ve dvou fázích:
Interakce antigenu s nekompletními protilátkami. Nejsou žádné viditelné projevy. První fáze je dokončena promytím antigenu ze zbývajícího séra pacienta.
Interakce antiglobulinového séra získaného jako výsledek imunizace zvířete lidským globulinem s nekompletními protilátkami adsorbovanými na antigen. Vzhledem k tomu, že antiglobulinové protilátky jsou bivalentní, vážou dvě monovalentní protilátky samostatných komplexů antigen + neúplná protilátka, což vede k jejich slepení a vzniku viditelné sraženiny.
Aglutinační reakce Aglutinační reakce
(RA) je metoda pro identifikaci a kvantifikaci Ag a Ab na základě jejich schopnosti tvořit aglomeráty viditelné pouhým okem. Na oddělení infekčních nemocí. onemocnění nebo pro jiné účely se používá k identifikaci neznámých mikrobů a buněk, ke stanovení přítomnosti a množství Ab v krvi a jiných tekutinách. Princip stanovení je založen na specifičnosti interakce mezi Ag a Ab a spočívá v nalezení známého od neznámého. Existuje mnoho možností pro RA: kvantitativní a kvalitativní, zkumavky a skleněné, objemové a kapkové, konvenční, zrychlené a expresní metody. Pro fázi RA potřebujete: 1) s-ka krev. Ve variantě s určením typu (var) bakterií jsou použity průmyslové aglutinační testy vyrobené imunizací králíků. Ve variantě s určením typu Ab je z testu odebrán vzorek krve. lidí nebo zvířat. Roztok musí být sterilní a bez suspendovaných částic. Připravte základní ředění ve fyziologickém roztoku. Měl by být 2-4krát nižší než diagnostický titr pro toto onemocnění; 2) Ag. Ve verzi reakce s určením typu Ab se používají průmyslové diagnostické soupravy; ve variantě se stanovením Ag se diagnostika připravují sama ve formě suspenze 1-3 miliardy ve fyziologickém roztoku 18-20hodinového agarového (méně často bujónového) testu. mikrob inaktivovaný zahříváním ve vodní lázni při 70 °C po dobu 1 hodiny nebo 24hodinovou inkubací při 37 °C s formaldehydem (konečná koncentrace 0,2 %); 3) elektrolyt ve formě solného roztoku. Inscenační technika objemová sériová trubice RA pro stanovení titru Ab v s-ki: z hlavního ředění s-ki se připraví několik řad pracovních ředění. Počet řádků závisí na počtu diagnostických vyšetření v experimentu, počet a diluční faktory jsou určeny diagnostickým titrem suspektního onemocnění. Série musí obsahovat alespoň ředění odpovídající diagnostickému titru Ab, dvě ředění pod ním a dvě ředění nad ním. je-li například diagnostický titr 1:100, pak s volumetrickou metodou stagingu RA by měly být připraveny následující ředění: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; s kapáním metoda, první ředění (1:25) není potřeba, ale je potřeba další vyšší ředění - 1:800. vědecký výzkum s-ku se titruje do negativní reakce. Ředí se následovně: 0,25 ml fyziologického roztoku se nalije do všech zkumavek kromě 1., kdy se reakce provádí v objemu 0,5 ml, a 0,5 ml, pokud se reakce provádí v objemu 1. ml. Nalijte 0,25 (0,5) ml hlavního ředění do 1. a 2. zkumavky, z 2. zkumavky, do odříznutého objemu a chovný s-k a zvýšené 2x se převede 0,25 (0,5) ml na 3., z 3. na 4. atd. do posledního se z odřezku do všeho nalije 0,25 (0,5) ml, aby se vyrovnaly objemy. Každé ředění se provádí pomocí samostatné pipety. Pokud se do experimentu vezme několik diagnostik, pak se pro každé z nich připraví jeho vlastní série ředění stejným způsobem. Diagnosticum se přidává do každého ředění zkumavky v objemu rovném objemu zkumavky, v důsledku čehož se ředění v každé zkumavce zdvojnásobí. Experiment odpovídá kontrole s-ki (0,25 - 0,5 ml hlavního ředění s-ki a stejné množství fyziologického roztoku) a kontrole Ag (0,25 - 0,5 ml diagnostika a stejné množství fyziologického roztoku). Pokud je v experimentu použito několik diagnostických prostředků, pak má každý svou vlastní antigenní kontrolu. Stojan se zkumavkami se dobře protřepe a umístí na 4 hodiny do termostatu při 37 °C a poté se nechá při pokojové teplotě do druhého dne, poté se zaznamená PA na základě množství sedimentu a stupně vyjasnění. kapalina. Stanovení těchto indikátorů v závislosti na povaze aglutinátů se provádí pouhým okem na tmavém pozadí, v aglutinoskopu nebo přes konkávní povrch zrcátka mikroskopu. Počítání začíná kontrolami: kontrola C by měla být průhledná, Ag by mělo být rovnoměrně zakalené (po protřepání zkumavky). Pokud jsou kontroly dobré, zjistěte přítomnost a stupeň aglutinace ve všech zkumavkách, které jsou označeny plusy: velký sediment a úplné vyčeření kapaliny - 4 plusy; velký sediment a neúplné čištění kapaliny - 3 plusy; znatelný sediment a znatelné čištění kapaliny jsou 2 plusy. Poté se stanoví titr: nejvyšší ředění s intenzitou aglutinace alespoň 2 plusy. Výzkum titru s-ki jsou porovnány s diagnostickým titrem pro toto onemocnění. Pokud se vyšetřuje titr. s-ki je 2x nižší než diagnostická hodnota, reakce je hodnocena jako pochybná; pokud je titr stejný diagnostika - jak slabě pozitivní; je-li 2-4krát vyšší, považuje se za kladný, je-li 8krát a vícekrát vyšší, považuje se za ostře pozitivní. S rozšířenou distribucí Ab zdravých lidí K posouzení RA se používá zvýšení titru Ab. Pro určení typu Ar v sériovém RA musí počet řádků odpovídat počtu použitému pro identifikaci diagnostické testy. Z hlavního ředění diagnostického testu se připraví série po sobě jdoucích dvojnásobných ředění stejným způsobem jako u RA pro stanovení titru Ab. Faktory ředění závisí na titru aglutinačního testu.V experimentu je nutná přítomnost ředění rovného titru testu a také 2, 4, 6, 8 krát nižšího než je. titr diagnostického testu je 1 3200, pak byste měli použít ředění 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Stejný objem testovaného Ag se přidá do ředění testu, výsledkem je ředění test se zvýší 2krát.Do experimentu se přidají 2 kontroly testu a Ag. Pokud je v experimentu zapojeno několik s-k, pak každý z nich potřebuje svou kontrolu Po dokončení reakce se stojanem silně zatřese a umístí v termostatu při 37 ° C. Výsledky se berou v úvahu, jak je popsáno výše.. Hodnocení reakce má vlastnosti Aby bylo možné vyvodit závěr o souladu studie. Ag vzatý do experimentu musí titr reakce odpovídat alespoň polovině titru standardního diagnostického testu Titry 1 4 a nižší jsou považovány za skupinovou reakci Kapat md staging RA se od volumetrického liší tím, že s-ku se ředí v objemu 1 ml, Ag se používá ve vyšší koncentraci (10 miliard/ml) a přidává se 1 - 2 kapky do zkumavky Ředění léčiva po přidání Ag se považuje za nezměněné Jinak je způsob nastavení, zaznamenávání a vyhodnocení obdobný jako u objemové metody
(Zdroj: Slovník pojmů mikrobiologie)
