Rekombinant to'qima plazminogen aktivatori TPAga (to'qima plazminogen faollashtiruvchisi, omil III, tromboplastin, TAP) kiradi. O'tkir davrda bemorlarni davolash

"Eozinofiller. Monositlar. Trombotsitlar. Gemostaz. Qon ivish tizimi. Antikoagulyant qon tizimi.":
1. Eozinofillar. Eozinofiller funktsiyasi. Eozinofilik leykotsitlarning funktsiyalari. Eozinofiliya.
2. Monotsitlar. Makrofaglar. Monositlarning funktsiyalari - makrofaglar. Monotsitlarning normal soni makrofaglardir.
3. Granulotsitopoez va monotsitopoezni tartibga solish. Granulotsitlar koloniyasini qo'zg'atuvchi omillar. Keylonlar.
4. Trombotsitlar. Trombotsitlar tuzilishi. Trombotsitlar funktsiyasi. Glikoproteinlarning funktsiyalari. Sol zonasi - gialoplazma jeli.
5. Trombotsitopoez. Trombotsitopoezni tartibga solish. Trombopoetin (trombotsitopoetin). Megakaryotsitlar. Trombotsitopeniya.
6. Gemostaz. Qon ivish mexanizmlari. Trombotsit gemostazi. Trombotsitlar reaktsiyasi. Birlamchi gemostaz.
7. Qon ivish tizimi. Qon ivishini faollashtirish uchun tashqi yo'l. Pıhtılaşma omillari.
8. Qon ivishini faollashtirishning ichki yo'li. Trombin.
9. Qonning antikoagulyant tizimi. Qonning antikoagulyant mexanizmlari. Antitrombin. Geparin. Proteinlar. Prostatsiklin. Trombomodulin.
10. To'qimali plazminogen aktivator. Ektoenzimlar. Antikoagulyant tizimda endoteliyning roli. To'qimalar omili. Plazminogen aktivator inhibitori. Fon Villebrand omili. Antikoagulyantlar.

To'qimalarning plazminogen aktivatori. Ektoenzimlar. Antikoagulyant tizimda endoteliyning roli. To'qimalar omili. Plazminogen aktivator inhibitori. Fon Villebrand omili. Antikoagulyantlar.

To'qimalarning plazminogen aktivatori Bu ko'payadigan va doimiy ravishda qon tomir endoteliy tomonidan ishlab chiqariladigan protein. Yaratilgan trombaga qarshi to'g'ridan-to'g'ri mahalliy trombolitik faollikni ta'minlaydi. Qonda ushbu omilning doimiy darajasi saqlanib qoladi, bu qonning tizimli trombolitik faolligini ta'minlaydi.

Ektoenzimlar - Bular ADPase, ATPase va endoteliy tomonidan ishlab chiqarilgan adenozinga aylantiruvchi ferment. Endotelial ADPase faollashtirilgan trombotsitlar bilan ajralib turadigan proagregatsiyalangan ADPni tezda parchalaydi.

Qon tomir endotelial hujayralar sintez qiling va protrombotik omillar: to'qima omil, plazminogen aktivator inhibitörleri, von Villebrand omili.

Anjir. 7.11. Qon ivishida qon tomir endoteliyining roli. Antikoagulyant ta'sirga ega bo'lgan endotelial omillar "antikoagulyantlar" yozuvi ostida trombotsitlar yig'ilishini inhibe qilish, fibrin pıhtının shakllanishi va fibrinolizning faollashishi tufayli ko'rsatilgan. Trombotsitlar trombusi, fibrin laxtasi va fibrinolizni bostiruvchi endotelial omillar "Procoagulants" nomi bilan ko'rsatilgan.

To'qimalar omili 46 kDa og'irlikdagi hujayra membranasining murakkab oqsilidir. Hujayra shikastlanganda uning molekulalarining bir qismi tashqi qon ivishida tezlatuvchi vazifasini bajaruvchi Vila koagulyatsion omiliga mahkam bog'lanadi.

Plazminogen aktivator inhibitori-Men aylanayotgan qonda topilgan 52 kDa oqsil. Plazminogen aktivator bilan yaqin bog'lanib, uni faollashtiradi va shu bilan organizmdagi fibrinolizni tartibga solishda ishtirok etadi.

Fon Villebrand omili Bu og'irligi 1-20 million Da bo'lgan, endoteliy tomonidan sintezlanadigan va endotelial sekretor granulalarida saqlanadigan ko'p o'lchovli molekuladir. Ulardan ozod qilinib, trombotsitlar uchun yopishtiruvchi molekula vazifasini bajaradi, ularning agregatsiyasini qo'llab-quvvatlaydi. Fon Villebrand faktorining endoteliydan ko'payishi trombin ta'sirida yuzaga keladi.

Tomirdagi qon ivishfaol protrombinazaning ichki shakllanishiga to'sqinlik qiladigan endoteliyning silliq yuzasini oldini oladi. Endoteliy yuzasida adsorbsiyalangan monolekulyar oqsil qatlami ivish omillari va trombotsitlarni qo'zg'atadi, shuningdek qon ivishini oldini oladi.

Antikoagulyantlar klinik amaliyotda qo'llaniladi. Masalan, yurak tomirlari kasalligi bilan og'rigan bemorlarda qon koagulyatsiyasining kuchayishini kamaytirish, qon hujayralari shikastlanishiga olib keladigan sun'iy qon aylanish apparati ishlatilganda qonni suyuq holatda ushlab turish, buning natijasida ichki qon ivish yo'li faollashadi.

farmakologik ta'sir

Trombolitik. Rekombinant inson to'qimalari plazminogen aktivatori, glikoprotein.

Vena ichiga yuborilganda preparat tizim aylanishida nisbatan faol emas. U fibringa bog'langandan so'ng faollashadi va plazminogenning plazminga aylanishiga olib keladi, bu esa fibrin pıhtısının tarqalishiga olib keladi.

Qo'llashda Aktilizatsiya qiling alfa-gidroksibutirat dehidrogenaz fermentining chiqishi kamayadi.

Ilova Aktilizatsiya qiling 100 mg dozada 90 daqiqa davomida, geparinni vena ichiga yuborish bilan birgalikda o'tkir miokard infarkti bo'lgan 40 mingdan ortiq bemorlarda (GUSTO tadqiqotlari) streptokinaza (1,5 mln.) bilan solishtirganda 30 kunlik o'limning (6,3%) kamayishiga olib keldi. 60 daqiqa ichida) bir vaqtning o'zida geparinni teri ostiga yoki tomir ichiga yuborish (7,3%). Qabul qilingan bemorlarda 60 daqiqadan 90 daqiqagacha trombolizadan keyin ekanligi ko'rsatildi Aktilizatsiya qiling , infarkt zonasida qon tomir patentsiyasini tiklanishning streptokinaza nisbatan yuqori chastotasi kuzatildi. Terapiya boshlanganidan 180 minut o'tgach va undan keyin tomir patentsiyasi chastotasida farqlar kuzatilmadi.

Qo'llashda Aktilizatsiya qiling trombolitik terapiya olmagan bemorlarga nisbatan miyokard infarktidan keyin 30 kunlik o'lim ko'rsatkichi pasaygan.

Qabul qilingan bemorlarda Aktilizatsiya qiling trombolitik terapiyani qabul qilmagan bemorlarga qaraganda, yurakning chap qorinchasining umumiy funktsiyalariga va mahalliy devor harakatchanligiga kam ziyon etkazildi.

Platsebo tomonidan boshqariladigan o'rganish (LATE) foydalanish ekanligini ko'rsatdi Aktilizatsiya qiling miyokard infarkti bo'lgan bemorlarda 3 soat davomida 100 mg dozada (simptomlar boshlanganidan keyin 6-12 soat ichida terapiya boshlanganda) platseboga nisbatan 30 kunlik o'limning pasayishiga olib keldi. Tasdiqlangan miyokard infarkti bo'lgan bemorlarda terapevtik ta'sir simptomlar boshlanganidan keyin 24 soat ichida davolanish boshlangan hollarda ham kuzatilgan.

O'tkir massiv o'pka emboliyasi, beqaror gemodinamika bilan og'rigan bemorlarda foydalaning Aktilizatsiya qiling trombüs hajmining tez pasayishiga va o'pka arteriyasida bosimning pasayishiga olib keladi, ammo o'lim haqida ma'lumotlar yo'q.

Preparatning insultga ta'sirini o'rgangan (NINDS A / B) AQShda o'tkazilgan ikkita tadqiqot (alomatlar boshlanganidan keyingi dastlabki 3 soat ichida) ijobiy natijaga (nogironlik yoki ushbu kasalliklarning minimal og'irligi) tez-tez erishib borishni aniqlamadi. platsebo bilan taqqoslaganda.

Keyinchalik terapiya boshlangan bo'lsa, preparatning samaradorligi pasayadi, bu ikki Evropa tadqiqotida va Qo'shma Shtatlarda o'tkazilgan qo'shimcha tadqiqotda ko'rsatildi.

Qon tomirining boshlanishidan keyingi dastlabki 3 soat ichida terapiya olgan barcha bemorlarning meta-tahlil natijalari alteplazning ijobiy ta'sirini tasdiqladi.

Jiddiy va hatto o'limga olib keladigan intrakranial qonash xavfi ortishiga qaramay, platsebo bilan solishtirganda ijobiy davolanish natijasini ishlab chiqish ehtimoli 14,9% (95% ishonch oralig'i: 8,1% va 21,7%). Ushbu ma'lumotlar terapiyaning o'limga ta'siri to'g'risida aniq xulosa qilishga imkon bermaydi. Qon quyilishi boshlanganidan keyin 3 soat ichida olteplazadan foydalanganda foyda va xavf nisbati (yuqorida aytilgan ogohlantirishlarni hisobga olgan holda) odatda ijobiy deb hisoblanishi mumkin, ammo tadqiqot ma'lumotlari terapiyaning o'limga ta'siri to'g'risida aniq xulosaga kelishga imkon bermaydi.

Mavjud barcha klinik ma'lumotlarning meta-tahlili shuni ko'rsatadiki, alteplaz davolash semptomlar boshlanganidan 3-6 soat o'tgach boshlangan bemorlarda klinik ko'rinish boshlanganidan keyingi dastlabki 3 soat ichida o'tkazilgan terapiya bilan solishtirganda samarasizdir. Shu bilan birga, birinchi holda qon tomir terapiyasining asoratlari xavfi yuqori, bu foyda / xavf nisbati bo'yicha noqulay natijaga olib keladi.

Fibrinning nisbiy o'ziga xosligi sababli, 100 mg dozada alteplazadan foydalanish aylanma fibrinogen darajasining o'rtacha pasayishiga olib keladi (4 soatdan keyin taxminan 60% gacha), bu esa 24 soatgacha 80% ga ko'payadi. 4 soatdan keyin plazminogen va alfa-2-antiplazmaning kontsentratsiyasi mos ravishda boshlang'ich sathidan 20% va 35% gacha pasayadi va 24 soatdan keyin ular yana 80% ga ko'tariladi. Aylanib yuruvchi fibrinogen darajasining sezilarli va uzoq muddatli pasayishi faqat kam sonli bemorlarda qayd etildi.

Farmakokinetikasi

Aktilizatsiya qiling tezda qon oqimidan chiqariladi va asosan jigarda metabollanadi. Preparatning plazma klirensi soatiga 550-680 ml ni tashkil qiladi.

A-fazada T 1/2 4-5 minut. Bu shuni anglatadiki, 20 daqiqadan so'ng plazmadagi preparatning boshlang'ich miqdoridan 10% kamroq bo'ladi. Preparatning qolgan miqdori uchun 1/ fazadagi T 1/2 taxminan 40 minut.

Ko'rsatmalar

- alomatlar boshlanganidan keyingi dastlabki 6 soat ichida o'tkir miyokard infarkti trombolitik terapiyasi (90 daqiqali / tezlashtirilgan / dozalash rejimi);

- alomatlar boshlanganidan keyin 6 dan 12 soatgacha bo'lgan davrda o'tkir miyokard infarkti trombolitik terapiyasi (3 soatlik dozalash rejimi);

- O'pka arteriyasining o'tkir massiv tromboemboliyasining trombolitik terapiyasi, beqaror gemodinamika bilan birga, tashxis iloji bo'lsa, ob'ektiv ravishda tasdiqlanishi kerak (masalan, o'pka angiografiyasi yoki invaziv bo'lmagan usullar, masalan, o'pka tomografiyasi). O'pka emboliyasining o'limi va uzoq muddatli natijalari bo'yicha klinik tadqiqotlar o'tkazilmagan;

- O'tkir ishemik insultning trombolitik terapiyasi (agar insult belgilari paydo bo'lganidan keyin 3 soat ichida buyurilgan bo'lsa va intrakranial qonash / gemorragik insult / agar ko'rishning tegishli usullari, masalan miyaning kompyuter tomografiyasi qo'llanilsa) buyuriladi.

Dozalash tartibi

Aktilizatsiya qiling alomatlar boshlanganidan keyin imkon qadar erta qo'llanilishi kerak.

Qachon simptomlar boshlanganidan keyin 6 soat ichida davolashni boshlash mumkin bo'lgan bemorlar uchun 90 daqiqali (tezlashtirilgan) dozalash miyokard infarkti, preparat tomir ichiga 15 mg dozada, so'ngra dastlabki 30 minut davomida 50 mg tomir ichiga yuboriladi, so'ngra 100 mg maksimal dozaga erishilgunga qadar 60 daqiqadan so'ng 35 mg dan infuziya buyuriladi.

Preparatning dozasi tana vazniga qarab hisoblanishi kerak. Dastlab, preparat tomir ichiga tomir ichiga 15 mg dozada, so'ngra - 750 mkg / kg tana vazniga (maksimal 50 mg) 30 daqiqa davomida tomir ichiga tomiziladi, so'ngra 60 minut davomida 500 mkg / kg (maksimal 35 mg) infuziya qilinadi. ...

Qachon alomatlar boshlanganidan 6 soatdan 12 soatgacha davolanishni boshlashi mumkin bo'lgan bemorlar uchun 3 soatlik dozalash rejimi bilan miyokard infarkti, preparat vena ichiga 10 mg dozada, so'ngra birinchi soat davomida 50 mg vena ichiga yuboriladi, so'ngra 3 soat ichida 100 mg maksimal dozaga erishilguncha 30 daqiqa davomida 10 mg tomir ichiga yuboriladi.

Bor og'irligi 65 kg dan kam bo'lgan bemorlar umumiy doz 1,5 mg / kg dan oshmasligi kerak.

Adjunktiv terapiya: atsetilsalitsil kislotasi tromboz boshlanganidan keyin imkon qadar erta tayinlanishi kerak va miyokard infarktidan keyingi dastlabki oylarda qabul qilishni davom ettirish kerak. Tavsiya etilgan dozasi kuniga 160-300 mg. Shu bilan birga, 24 soat yoki undan ko'proq vaqt davomida geparinni qo'llashni boshlash kerak (tezlashtirilgan dozalash rejimi bilan - kamida 48 soat). Trombolitik terapiyani boshlashdan oldin geparinni 5000 U / soat dozasida tomir ichiga yuborish tavsiya etiladi. Keyinchalik, geparin infuziya orqali 1000 U / soat tezlikda yuboriladi. Geparinning dozasi takroriy aniqlash natijalariga qarab sozlanishi kerak (qiymatlar boshlang'ich darajadan 1,5-2,5 martaga oshishi kerak).

Qachon pulmoner emboliya Aktilizatsiya qiling Umumiy doz 100 mg dozada 2 soat davomida yuboriladi. Eng katta tajriba quyidagi dozalash rejimi yordamida olingan: avval preparat 10 mg IV oqim dozasida 1-2 minut davomida, so'ngra 90 mg IV tomchida 2 soat davomida yuboriladi. . Da og'irligi 65 kg dan kam bo'lgan bemorlar umumiy doz 1,5 mg / kg tana vaznidan oshmasligi kerak.

Adjunktiv terapiya: dasturdan keyin Aktilizatsiya qiling agar APTT boshlang'ich darajasidan 2 baravar kam bo'lsa, geparin buyurilishi kerak (yoki davom ettiriladi). Keyinchalik infuziya ham APTT nazorati ostida amalga oshiriladi, ular boshlang'ich darajadan 1,5-2,5 baravar ko'p bo'lishi kerak.

Qachon o'tkir ishemik insult tavsiya etilgan doz 900 mkg / kg ni tashkil qiladi (maksimal 90 mg), bu preparat dozasini vena ichiga dastlabki yuborilganidan keyin 60 minut ichida tomir ichiga yuboriladi, bu umumiy dozaning 10% ni tashkil qiladi. Terapiya semptomlar boshlanganidan keyin iloji boricha tezroq boshlanishi kerak (yaxshisi 3 soat ichida).

Adjunktiv terapiya: Semptomlar boshlanganidan keyingi dastlabki 24 soat ichida geparin va atsetilsalitsil kislotasi bilan birgalikda qo'llanilgan yuqorida keltirilgan terapiya rejimining xavfsizligi va samaradorligi etarli darajada o'rganilmagan. Shu munosabat bilan, terapiya boshlanganidan keyingi dastlabki 24 soat ichida Aktilizatsiya qiling atsetilsalitsil kislotasi yoki tomir ichiga yuborilgan geparinni iste'mol qilishdan saqlanish kerak. Agar geparinni qo'llash boshqa ko'rsatkichlar uchun zarur bo'lsa (masalan, chuqur tomir trombozining oldini olish uchun), uning dozasi kuniga 10 000 IU dan oshmasligi kerak, shu bilan birga preparat teri ostiga kiritiladi.

Infuziya uchun eritma tayyorlash qoidalari

Flakon tarkibidagi lyofilizatsiyalangan kukun (50 mg) steril sharoitda in'ektsiya uchun 50 ml suv bilan eritiladi. Alteplazning oxirgi konsentratsiyasi 1 mg / ml ni tashkil qiladi.

Olingan eritma steril tuz bilan (0,9%) minimal aleplazaning 0,2 mg / ml kontsentratsiyasiga qadar suyultirilishi mumkin.

Olingan dastlabki eritmani in'ektsiya uchun suv bilan suyultirilmaslik yoki dekstroz kabi uglevodlarga asoslangan infuzion eritmalar kerak.

Suyultirilgandan so'ng, olingan eritma yuqorida aytib o'tilganidek tomir ichiga yuboriladi.

Yon ta'siri

Eng ko'p uchraydigan yon ta'sir qon ketishdir, natijada gematokrit va / yoki gemoglobin kamayadi.

Trombolitik terapiya bilan bog'liq qon ketishini ikki asosiy toifaga bo'lish mumkin:

- tashqi qonash (odatda ponksiyon joylaridan yoki qon tomirlariga zarar etkazishidan);

- oshqozon-ichak trakti, siydik yo'llaridan ichki qon ketish, qorin parda orti bo'shlig'iga qon ketish, miyada qon ketish yoki parenxima a'zolaridan qon ketish.

Quyidagi ma'lumotlar klinik sinovlarga asoslangan. Aktilizatsiya qiling o'tkir miokard infarkti bo'lgan 8299 bemorda.

Xolesterin kristalli embolizatsiyasi holati klinik sinovlarda alohida hisobotga asoslanadi.

Miyokard infarkti bo'yicha o'tkazilgan tadqiqotlar bilan taqqoslaganda, o'pka emboliyasi va qon tomir kasalligi bilan og'rigan bemorlarning soni klinik sinovlarda qatnashgan (ushbu kasalliklarning alomatlari paydo bo'lganidan 0-3 soat ichida). Shuning uchun miokard infarkti bilan olingan ma'lumotlar bilan solishtirganda qayd etilgan kichik miqdordagi farqlar, namuna hajmining kichikligi bilan bog'liq edi. İntrakranial qon ketishdan (qon tomirida yon ta'sir sifatida) va reperfuzion aritmiyalardan (miyokard infarktining yon ta'siri sifatida) tashqari, preparatning yon ta'siri spektrida sifatli va miqdoriy farqlarni taxmin qilish uchun klinik sabab yo'q. Aktilizatsiya qiling agar u o'pka emboliyasi va o'tkir ishemik insultda yoki miyokard infarktida qo'llanilsa.

Miyokard infarktida qo'llanilganda yon ta'sir

Juda tez-tez: hayot uchun xavf tug'diradigan va an'anaviy antiaritmik terapiyani qo'llashni talab qiladigan reperfuzion aritmiyalar.

Yon ta'siri miyokard infarkti va o'pka emboliyasida qo'llanganda qayd etiladi

Kamdan-kam hollarda: intrakranial qonash.

O'tkir ishemik insultda qo'llanilganda yon ta'sir

Ko'pincha: intrakranial qonash. Asosiy salbiy voqea klinik ko'rinadigan intrakranial qonash edi (ularning chastotasi 10% ga etdi). Ammo asoratlar darajasi yoki umuman o'lim ko'rsatkichi oshmadi.

Miyokard infarkti, o'pka emboliyasi va o'tkir ishemik insultda ishlatilganda qayd etilgan yon ta'sirlar

Juda tez-tez: tashqi qonash, odatda ponksiyon joylaridan yoki shikastlangan qon tomirlaridan, qon bosimini pasaytiradi.

Ko'pincha: oshqozon-ichak traktidan qon ketish, ko'ngil aynish, qusish (ko'ngil aynishi va qusish miyokard infarkti alomatlari ham bo'lishi mumkin), isitma, siydik yo'llaridan qon ketish, burun bo'shlig'i, ekximoz.

Har doim ham emas: qorin parda orti bo'shlig'ida qon ketish, tish go'shtidan qon ketish, tromboemboliya, bu zararlangan ichki organlarning tegishli oqibatlari bilan birga bo'lishi mumkin. Anafilaktoid reaktsiyalari qayd etildi (odatda engil, ammo ba'zi hollarda hayot uchun xavfli bo'lishi mumkin); toshma, ürtiker, bronxospazm, angioedema, gipotenziya, zarba yoki boshqa har qanday allergik reaktsiyalar mumkin. Ushbu reaktsiyalar rivojlanganda an'anaviy antiallergik terapiyadan foydalanish kerak. Shunga o'xshash reaktsiyalari bo'lgan bemorlarning nisbatan katta qismida ACE inhibitörleri bir vaqtning o'zida ishlatilganligi aniqlandi. Anafilaktik reaktsiyalar (ya'ni, IgE vositachiligi) uchun Aktilizatsiya qiling noma'lum.

Kamdan-kam hollarda: antijismlarning vaqtinchalik shakllanishi Aktilizatsiya qiling (past kreditlarda), ammo bu hodisaning klinik ahamiyati aniqlanmagan; xolesterin kristallari bilan embolizatsiya, bu ta'sirlangan ichki organlardan tegishli oqibatlarga olib kelishi mumkin; parenximadan qon ketish.

Ko'pincha qon quyish kerak edi.

Qo'llash mumkin bo'lmagan holatlar

- gemorragik diatez;

- hozirgi vaqtda yoki oldingi 6 oy ichida sezilarli qon ketish;

- og'izdan antikoagulyantlarni bir vaqtda ishlatish, masalan, varfarin (xalqaro normallashtirilgan nisbati\u003e 1.3);

- markaziy asab tizimining kasalliklari tarixi (shu jumladan neoplazmalar, anevrizmalar);

- miya yoki orqa miya jarrohligi;

- hozirgi vaqtda yoki anamnezda intrakranial (shu jumladan subaraknoid) qon ketish;

- gemorragik inmadan shubha qilingan;

- kuchli nazoratsiz arterial gipertenziya;

- oldingi 10 kun ichida katta jarrohlik yoki og'ir travma (shu jumladan o'tkir miyokard infarkti bilan bog'liq har qanday travma);

- yaqinda boshning shikastlanishi;

- uzoq muddatli yoki travmatik kardiopulmoner reanimatsiya (2 daqiqadan ko'proq), oldingi 10 kun ichida bola tug'ilishi;

- Yaqinda siqilmaydigan qon tomirlarini ponksiyon qilish (masalan, subklavian va juguler venalari);

- gemorragik retinopatiya (shu jumladan qandli diabet), bu ko'rishning buzilishini ko'rsatishi mumkin;

- ko'zning boshqa gemorragik kasalliklari;

- bakterial endokardit;

- perikardit;

- o'tkir pankreatit;

- so'nggi 3 oy ichida oshqozon yarasi va o'n ikki barmoqli ichak yarasi tasdiqlangan;

- og'ir jigar kasalligi, shu jumladan jigar etishmovchiligi, jigar sirrozi, portal gipertenziya (qizilo'ngachning varikoz tomirlari bilan), faol gepatit;

- arterial anevrizmalar, arteriya va tomirlarning tug'ma nuqsonlari;

- qon ketish xavfi yuqori bo'lgan neoplazmalar;

- dori tarkibiy qismlariga yuqori sezuvchanlik.

Preparatni o'tkir miyokard infarkti va o'pka emboliyasini davolashda yuqorida ko'rsatilgan kontrendikatsiyalarga qo'shimcha ravishda quyidagi kontrendikatsiyalar mavjud:

- qon tomir tarixi.

Preparatni o'tkir ishemik insultni davolashda qo'llashda yuqorida ko'rsatilgan kontrendikatsiyalarga qo'shimcha ravishda quyidagi kontrendikatsiyalar mavjud:

- infuziya boshlanishidan 3 soat oldin ishemik insult alomatlarining paydo bo'lishi yoki kasallikning boshlanish vaqti to'g'risida aniq ma'lumot yo'qligi;

- o'tkir ishemik insult yoki engil simptomlar holatini infuziya boshlanishiga qadar tez yaxshilash;

- klinik dalillarga (masalan, NIHSS balli\u003e 25 bo'lsa) va / yoki ko'rish usullarining tegishli natijalariga asoslangan og'ir insult;

- insult boshidagi konvulsiyalar;

- oldingi 3 oyda qon tomir yoki jiddiy bosh jarohati to'g'risidagi ma'lumotlar;

- qandli diabet fonida oldingi insultning paydo bo'lishi;

- agar faollashtirilgan qisman trombin vaqti (APTT) ko'paytirilsa, geparinni insult boshlanishidan 48 soat oldin ishlatish;

- antiplatelet vositalarini infuziya paytida va infuziyadan keyin 24 soat ichida ishlatish;

- trombotsitlar soni 100,000 / mkl dan kam;

- sistolik qon bosimi 185 mm Hg dan yuqori. Art., Yoki diastolik qon bosimi 110 mm Hg dan yuqori. San'at yoki qon bosimini ushbu chegaralarga qadar kamaytirish uchun intensiv terapiya (preparatlarni tomir ichiga yuborish) dan foydalanish kerak;

- qonda glyukoza darajasi 50 mg / dl dan kam yoki 400 mg / dl dan ortiq.

Dori Aktilizatsiya qiling 18 yoshgacha bo'lgan bolalar va o'smirlarda va 80 yoshdan oshgan kattalarda o'tkir insultni davolash uchun ko'rsatilmagan.

Homiladorlik va laktatsiya davrida qo'llash

Klinik tajriba Aktilizatsiya qiling homiladorlik va laktatsiya davrida cheklangan. Ko'krak sutiga aleplazani ajratish masalasi o'rganilmagan.

Agar homiladorlik va laktatsiya davrida preparatni (hayotga bevosita tahdid soladigan kasalliklar uchun) qo'llash zarur bo'lsa, ona uchun terapiyaning kutilayotgan foydalari va homila yoki chaqaloq uchun mumkin bo'lgan xavfni baholash kerak. Shu munosabat bilan, ilova Aktilizatsiya qiling homiladorlik paytida va emizish paytida foydalanish tavsiya etilmaydi.

Jigar funktsiyasini buzish uchun ariza

Preparat og'ir jigar kasalliklarida, shu jumladan jigar etishmovchiligi, jigar sirrozi, portal gipertenziya (qizilo'ngachning varikoz tomirlari bilan), faol gepatitda kontrendikedir.

maxsus ko'rsatmalar

Retseptlashda quyidagi hollarda Aktilizatsiya qiling Qon ketish xavfi va mo'ljallanayotgan foyda darajasi diqqat bilan baholanishi kerak:

- yaqinda o'tkazilgan IM in'ektsiyasi yoki biopsiya, katta tomirlarni ponksiyon qilish, reanimatsiya paytida yurak massaji singari yaqinda qilingan kichik amaliyotlar;

- qon ketish xavfi ortadigan kasalliklar (kontrendikatsiyalar ro'yxatida ko'rsatilmagan).

O'tkir miokard infarkti va o'pka emboliyasini davolashda preparatni ehtiyotkorlik bilan ishlatish kerak:

- sistolik qon bosimi 160 mm Hg dan yuqori;

- keksa yoshda, intrakranial qon ketish xavfi oshishi mumkin. Keksa yoshdagi bemorlar ushbu davolanishdan ko'proq foyda olishlari mumkinligi sababli, foyda / xavf nisbatlarini sinchkovlik bilan baholash zarur.

O'tkir ishemik insultni davolashda preparatni ehtiyotkorlik bilan ishlatish kerak, chunki dastur Aktilizatsiya qiling bemorlarning ushbu toifasida (ushbu preparatni boshqa ko'rsatmalar uchun qo'llash bilan solishtirganda) intrakranial qon ketishi xavfi yuqori bo'ladi, chunki qon ketish asosan nekrotik sohada bo'ladi.

Bu ayniqsa quyidagi hollarda e'tiborga olinishi kerak:

- "Qo'llash mumkin bo'lmagan holatlar" bo'limida keltirilgan barcha sharoitlar va umuman qon ketish xavfi yuqori bo'lgan barcha sharoitlar;

- kichik asemptomatik miya yarim anevrizmalarining mavjudligi;

- ilgari asetilsalitsil kislotasi yoki antiplatelet agentlari bilan davolangan bemorlarda, intraserebral qon ketishi xavfi yuqori bo'lishi mumkin, ayniqsa foydalanish Aktilizatsiya qiling keyinroq boshlangan. Miya qon ketishi xavfi ortganini hisobga olgan holda, ishlatiladigan alteplazning dozasi 900 mkg / kg dan oshmasligi kerak (maksimal doz 90 mg).

Davolashni simptomlar paydo bo'lganidan keyin 3 soatdan kechiktirmasdan, quyidagi holatlar tufayli foyda / xavf nisbati sababli boshlash kerak emas:

- davolashning ijobiy ta'siri terapiyaning kech boshlanishi bilan kamayadi;

- asosan asetilsalitsil kislotasini qabul qilgan bemorlarda o'lim ko'payadi;

- qon ketish xavfi ortadi.

Davolash Aktilizatsiya qiling trombolitik terapiya va uning samaradorligini kuzatish qobiliyatiga ega bo'lgan shifokor tomonidan amalga oshirilishi kerak. Foydalanish Aktilizatsiya qiling standart reanimatsiya uskunalari va tegishli dori-darmonlar mavjudligi tavsiya etiladi.

Terapiyaning eng keng tarqalgan asoratlari Aktilizatsiya qiling qon ketmoqda. Geparinni bir vaqtda iste'mol qilish qon ketishiga olib kelishi mumkin. Shu tarzda Aktilizatsiya qiling fibrinni eritib yuboradi, so'nggi teshilish joylarida qon ketishi mumkin. Shuning uchun trombolitik terapiya mumkin bo'lgan qon ketish joylarini (shu jumladan kateter qo'yish joylari, arterial va venoz ponksiyonlar, kesmalar va in'ektsiyalar) diqqat bilan kuzatishni talab qiladi. Davolash paytida qattiq kateterlardan, IM inyeksiyalaridan va asossiz manipulyatsiyalardan saqlaning Aktilizatsiya qiling .

Qattiq qon ketganda, ayniqsa miya, fibrinolitik terapiya, shuningdek, geparinni qo'llash darhol to'xtatilishi kerak. Agar geparin qon ketishining boshlanishidan 4 soat oldin ishlatilgan bo'lsa, protaminni qo'llash maqsadga muvofiqligini hisobga olish kerak. Kamdan kam hollarda yuqoridagi konservativ choralar samarasiz bo'lsa, qon mahsulotlarini iste'mol qilish ko'rsatilishi mumkin. Kryopraqibitni, yangi muzlatilgan plazma va trombotsitlarni transfüzyon bilan yuborish har bir administratsiyadan keyin qayta-qayta aniqlanadigan klinik va laborator ko'rsatkichlarga muvofiq belgilanishi mumkin. 1 g / l fibrinogen kontsentratsiyasiga erishilgunga qadar krioprakititni yuborish maqsadga muvofiqdir. Antifibrinolitik vositalarni (masalan, traneksamik kislota) ko'rib chiqish mumkin, ammo aniq tadqiqotlar o'tkazilmagan.

O'tkir miokard infarkti va o'pka emboliyasida foydalanmang Aktilizatsiya qiling 100 mg dan oshiq dozada va o'tkir ishemik insultda - 90 mg dan oshiq dozada, chunki intrakranial qonash xavfi ortadi.

Davolanish tugagandan so'ng, insonning rekombinatsiyalangan plazminogen aktivatoriga antikorlarning barqaror shakllanishi kuzatilmadi. Qayta foydalanish tajribasi tizimlashtirilgan Aktilizatsiya qiling hech kim yo'q. Agar anafilaktoid reaktsiyasi rivojlansa, infuziya to'xtatilishi va tegishli davolash buyurilishi kerak. Davolanishning tolerantligini muntazam ravishda monitoring qilish tavsiya etiladi, ayniqsa AEE inhibitori bilan bir vaqtda qabul qiluvchi bemorlarda.

O'tkir miokard infarktini davolashda quyidagi ehtiyot choralarini ko'rish kerak.

- koronar tromboliz reperfuziya bilan bog'liq aritmiyalarga olib kelishi mumkin;

- davolash boshlanganidan keyingi dastlabki 24 soat ichida glikoprotein IIb / IIIa antagonistlarini qo'llash tajribasi yo'q;

- Trombolitik vositalarni qo'llash chap yurak trombozi bo'lgan bemorlarda tromboemboliya xavfini oshirishi mumkin, masalan, mitral stenozli yoki atriyal fibrilatsiyali.

O'tkir ishemik insultni davolashda quyidagi ehtiyot choralarini hisobga olish kerak.

Davolash faqat nevrologik tekshiruvlarni o'tkazish qobiliyatiga ega bo'lgan ixtisoslashtirilgan bo'limda intensiv nevrologik yordam ko'rsatish ko'nikmalariga va tajribasiga ega tajribali shifokor tomonidan amalga oshirilishi kerak.

Davolash paytida va u tugaganidan keyin 24 soat ichida qon bosimini kuzatib borish kerak. Sistolik qon bosimining 180 mm Hg dan oshishi bilan. yoki 105 mm Hg dan past diastolik qon bosimi. IV antihipertenziv dorilar tavsiya etiladi.

Oldingi insult bilan og'rigan bemorlarda yoki nazoratsiz diabet kasalligi bo'lgan bemorlarda terapevtik ta'sir kamayadi. Bunday bemorlarda foyda / xavf darajasi kamroq ijobiy deb hisoblanadi, ammo u ijobiy bo'lib qolmoqda. Juda oz miqdordagi insultga chalingan bemorlarda xavf kutilgan foydadan katta, shuning uchun ulardan foydalanish Aktilizatsiya qiling Tavsiya etilmaydi.

Juda og'ir insultlar bo'lgan bemorlarda intrakranial qon ketish va o'lim xavfi ortadi. Bunday hollarda Aktilizatsiya qiling qo'llanilmasligi kerak.

Miya infarkti keng tarqalgan bemorlarda, shu jumladan yomon natijalar xavfi yuqori. intraserebral qon ketishi va o'lim. Bunday holatlarda terapiyaning zarari va foydasi sinchkovlik bilan o'lchanishi kerak.

Qon tomirida, davolanishning ijobiy natijasi ehtimolligi yoshga qarab pasayadi, chunki insultning og'irligi oshadi va qonda glyukoza darajasi ko'tariladi. Shu bilan birga, davolanishdan qat'i nazar, og'ir nogironlik va o'lim yoki jiddiy intrakranial qonash ehtimoli ortadi. Aktilizatsiya qiling 80 yoshdan oshgan bemorlarda, qattiq insult holatlarida (klinik ma'lumotlarga va / yoki tasviriy tadqiqotlar bo'yicha) va qonda glyukoza miqdori boshlang'ich ko'rsatkichi 50 mg / dl dan kam yoki 400 mg / dl dan oshiq bo'lgan holatlarda qo'llanilmasligi kerak.

Iskemik sohani takrorlash infarkt sohasida miya yarim shishiga olib kelishi mumkin. Qon ketish xavfi ortib borayotganligi sababli, trombolizdan so'ng alt 24 soat ichida trombotsitlar agregatsiyasi inhibitörlaridan foydalanishni boshlash kerak emas.

Pediatriyada qo'llang

Amaliy tajriba Aktilizatsiya qiling bolalarda u cheklangan.

Dozani oshirib yuborish

Alomatlar: Fibrinning nisbiy o'ziga xosligiga qaramay, dozani oshirib yuborish fibrinogen va koagulyatsion omillarning klinik ahamiyatli pasayishiga olib kelishi mumkin.

Davolash: ko'p holatlarda, kutish taktikasi ushbu omillarning fiziologik qayta tiklanishini kutish bilan kifoyalanadi. Aktilizatsiya qiling ... Agar qattiq qon ketsa, yangi muzlatilgan plazmani yoki yangi qonni quyish tavsiya etiladi va kerak bo'lganda sintetik antifibrinolitiklar buyurilishi mumkin.

Dori vositalarining o'zaro ta'siri

Maxsus o'zaro tadqiqotlar Aktilizatsiya qiling odatda o'tkir miokard infarktida ishlatiladigan boshqa dorilar bilan birga o'tkazilmagan.

Terining boshlanishidan oldin, terapiya paytida yoki undan keyin qon ivishiga yoki trombotsitlar funktsiyasini o'zgartiradigan dorilarni qo'llash Aktilizatsiya qiling qon ketish xavfini oshirishi mumkin.

ACE inhibitörlerini bir vaqtning o'zida qo'llash anafilaktoid reaktsiyalar xavfini oshirishi mumkin. Ushbu reaktsiyalar ACE inhibitörleri bilan davolangan bemorlarning nisbatan katta qismida kuzatildi.

Farmatsevtik o'zaro ta'sirlar

Dori Aktilizatsiya qiling Boshqa dorilar bilan (hatto geparin bilan) na infuzion idishga, na tomir ichiga yuborishning umumiy tizimiga qo'shib bo'lmaydi.

Dorixonalardan berish shartlari

Preparat retsept bo'yicha mavjud.

Saqlash shartlari va muddatlari

Preparat qorong'i joyda, bolalar yeta olmaydigan joyda, 25 ° S dan yuqori bo'lmagan haroratda saqlanadi. Yaroqlilik muddati - 3 yil.

Tayyorlangan eritma muzlatgichda 24 soatgacha saqlanishi mumkin; 25 ° C dan yuqori bo'lmagan haroratda - 8 soatgacha.

To'qimali plazminogen aktivator - bu ajralib chiqqan proteazlar guruhiga tegishli protein. Plazminogenni uning faol shakliga o'zgartiradi - plazmin.

Alteplase (aktilizatsiya) - inson to'qimalarining rekombinant plazminogen faollashtiruvchisi

Eritma tayyorlash uchun lyofilizatsiyalangan kukun: 50 mg flakonda erituvchi bilan (100 ml) to'ldiriladi.

Antigenitet yo'qligi sababli uni qayta yuborish mumkin, shu jumladan streptokinaza bilan oldingi davolanishdan keyin trombus fibriniga yuqori tropizm mavjud.

Ma'muriy qabul qilishning standart rejimi: 15 mg preparatni «bolus» yuborish, 30 daqiqada 50 mg va keyingi soat davomida 35 mg tomchilab yuborish.

Reteplazauchinchi avlod trombolitik agenti. Preparatning yarim ajiratilish davri avvalgilariga qaraganda ancha uzoqroq, bu esa tomir ichiga ikki dozada (10 IU 30 minut oralig'i bilan) yuborishga imkon beradi.

Tenekteplaza (metalllashtirish)uchinchi avlod trombolitik agenti.

Yuqori selektivlikka ega, plazminogen-1 antiaktivatoriga yuqori qarshilik va uzoq umr ko'rish qobiliyatiga ega. Ushbu xususiyatlar tufayli tenekteplazni reaktivga bir marta yuborish mumkin. Tenecteplase dozasi vaznga bog'liq va taxminan 30-50 mg (0,53 mg / kg).

Bolusni yuborish imkoniyati mavjudligi sababli, preparatni prehospital bosqichda qo'llash tavsiya etiladi (prexospital trombolizning oltin standarti).

Trombolizga ko'rsatmalar:

1. EKG, ikki yoki undan ortiq qo'shni simlarda ST intervalining 1 mm dan oshishini (V 1-3 da, ST balandligi 2 mm dan oshadi) yoki chap to'plam filialining o'tkir blokadasi mavjudligini aniqlaydi (ehtimol, koronar arteriya subtotal okklyuziyasi oxirigacha o'sganda); yoki idioventrikulyar ritm.

2. Miyokard infarktining dastlabki 6 soati.

3. Miokard infarkti dastlabki 12 soat davom etadigan og'riq, ST segmentining ko'tarilishi va Q to'lqinining yo'qligi, agar miyokard infarkti tugamagan bo'lsa va "mozaik" klinik ko'rinish mavjud bo'lsa, 12 soatdan keyin trombolizani o'tkazish to'g'risida qaror klinik rasm, tarix va EKG asosida qabul qilinadi.

Trombolizga qarshi ko'rsatmalar:

Mutlaq:

· Gemorragik insult kechiktirildi.

Miya tomir tizimining shikastlanishi (arteriovenoz malformatsiya)

Miyaning malign neoplazmalari (birlamchi yoki metastatik).

Oldingi 3 oy ichida ishemik insult.

Aorta ajratadigan shubha anevrizmasi.

O'tkir qon ketish yoki gemorragik diatez.

Oldingi 3 oy ichida miya travmatik shikastlanishi yoki miya, orqa miya yoki yuz suyagiga neyroxirurgik aralashuv.

Trombolitik terapiyaga allergik reaktsiyalar tarixi.

Nisbiy

Jiddiy, yomon boshqariladigan gipertenziya tarixi

· Qabul paytida kuchli nazoratsiz arterial gipertenziya (qon bosimi 180/110 mm Hg dan yuqori).

· Miya qon aylanishining buzilishi, bundan 3 oy oldin, demans yoki intrakranial patologiya mutlaq kontrendikatsiyada ko'rsatilmagan.

INR darajasi yuqori bo'lgan bilvosita antikoagulyantlarni qabul qilish (3-4).

Oldingi 3 hafta davomida uzoq muddatli (10 daqiqadan ko'proq) reanimatsiya.

Oldingi 3 hafta ichida jarrohlik.

2-4 hafta oldin ichki qon ketish.

· Homiladorlik.

O'tkir davrda oshqozon yoki o'n ikki barmoqli ichakning oshqozon yarasi.

· Jigarning og'ir kasalligi.

Koroner reperfuziyaning samaradorligi mezonlari

Angiografiya:

0 daraja - qon oqimining etishmasligi: kontrast modda tromboz joyidan pastga o'tmaydi;

I daraja - minimal qon oqimi: kontrast modda qisman okklyuziya joyidan pastga kiradi, ammo koronar to'shakni to'ldirmaydi;

II daraja - qisman qon oqimi: kontrast modda okklyuziya joyidan o'tib, koronar arteriyani to'ldiradi, ammo oddiy tomirlarga qaraganda sekinroq;

III daraja - patensiyani to'liq tiklash: kontrast modda koronar arteriyani oklüzyon joyidan yuqori bo'lgan tezlikda to'ldiradi va bo'shatadi.

Invaziv bo'lmagan:

ST segmentining tezkor dinamikasi: Tromboliz boshlangandan 1,5 soat o'tgach, eng yuqori ko'tarilish bilan qo'rg'oshinning ST segmentidagi pasayish.

Reperfuziya ritmining buzilishi. Tromboliz boshlangandan 2-3 soat ichida tezlashtirilgan idioventrikulyar ritm va kech qorincha ekstrasistolalari eng ma'lumotli hisoblanadi.

Nekrozning biokimyoviy belgilarining tezkor dinamikasi. Reperfuziyaning biokimyoviy mezonlari - bu tromboliz boshlanganidan 90-120 daqiqadan so'ng nekroz belgilarining qon tarkibidagi ko'payishi ("yuvinish" fenomeni), CPK ning maksimal darajasiga 12 soatgacha, CPK-MB - 6 soatgacha, miyoglobin - boshidan 3 soatgacha. tromboliz.

Tromboliz boshlangandan 60 minutgacha intensivlikning tez pasayishi yoki og'riq sindromining to'liq yengilligi.

TIBBIY BOSHQA ASPEKTLAR

KASALLIK BERISh UChUN KO'RSATMA MEROSIDA

Miyokard infarkti

Iskemiya paytida buyurilgan dorilar miyokard kislorod iste'molini kamaytiradi (yurak urishi, qon bosimi va chap qorincha qisqarishi) va / yoki tomirlarning qisqarishiga olib keladi.

Β-bloker terapiyasi

Β-blokerlarning ta'sir etuvchi mexanizmlari quyidagilar:

Antihipertansif ta'sir... Bu renin sekretsiyasini inhibe qilish va angiotensin II ning shakllanishi, presinaptik β-adrenerjik retseptorlarning blokadasi, simpatik asab tugunlaridan norepinefrinni chiqarilishini va markaziy vazomotor faoliyatning pasayishini oshiradi. Renin, shuningdek angiotensin II va aldosteron ishlab chiqarishning pasayishi buyraklarning suxtaglomerulyar apparatlaridagi β1-adrenerjik retseptorlarning blokadasi natijasida ro'y beradi.

Anti-ishemik ta'sir... Beta-blokerlar miokardning kislorodga bo'lgan ehtiyojini yurak urish tezligini, miyokard qisqarish qobiliyatini va sistolik qon bosimini pasaytiradi. Bundan tashqari, yurak urish tezligining pasayishi natijasida kelib chiqadigan diastolning uzayishi miyokardiyal perfuziyaning ko'payishini ta'minlaydi.

Antiaritmik ta'sir... Yurakka to'g'ridan-to'g'ri elektrofizyologik ta'sirlar natijasida (yurak qisqarishi chastotasining pasayishi, ektopik yurak stimulyatorlarining spontan impulslarining pasayishi, o'tkazuvchanlikning pasayishi va atriyoventrikulyar tugunning refrakter davrining ko'payishi) simpatik ta'sirlar va miokard ishemiyasining pasayishiga, barotermikning amfektsiyasida yaxshilanish.

Koroner qon oqimining yaxshilanishi kuzatiladidiastolning cho'zilishi tufayli. Miyokard metabolizmini yaxshilash - katekolaminlar tomonidan qo'zg'atilgan yog 'to'qimalaridan erkin yog' kislotalari chiqarilishini inhibe qilish natijasida; β-adrenergik retseptorlarning sezgirligini tiklash; miyokarddagi oksidlovchi stressni kamaytirish.

Beta-blokerlar suvda va lipidlarda eruvchanligi bilan ajralib turadi. Yog'da eriydigan mahsulotlar (propranolol, metoprolol, oxprenolol, bisoprolol) oshqozon-ichak traktida oson so'riladi, jigarda tez metabollanadi, ko'p miqdorda tarqaladi va qon-miya to'sig'i orqali yaxshi kirib boradi. Aksincha, suvda eriydigan β-blokerlar (asebutolol, atenolol, betaxolol, karteolol, esmolol, nadolol, sotalol) yomonroq so'riladi, sekinroq metabollanadi va ularning yarim umri uzoqroq bo'ladi. Shuning uchun suvda eriydigan dorilarni kuniga bir marta olish mumkin.

Jigar funktsiyasi buzilgan taqdirda yog'da eriydigan β-adrenerjik blokerlarning yarim umri, buyrak funktsiyasi buzilgan hollarda esa suvda eriydiganlar ko'payadi. Bu jigar va buyrak etishmovchiligi bo'lgan bemorlarda ushbu guruhdagi agentlarni tanlash uchun asosdir.

Beqaror gemodinamika bilan(qon bosimining yomon nazorat qilinish xavfi yuqori, masalan, miyokard infarktining eng o'tkir yoki o'tkir davrida) qisqa ta'sir qiluvchi β-blokerlardan foydalanish oqilona, \u200b\u200bchunki bu sizga kasallikning klinik ko'rinishini nazorat qilish imkonini beradi.

Yorliq. Anaprilini 20 mg 1 tabletkadan kuniga 3-4 marta.

Sol 1% (2,5 mg) anaprilini eritmasi 1:10 dan 0,9% NaCl eritmasida vena ichiga asta-sekin fraktsion dozalarda 1 mg dan boshlab, ta'sirga va chidamliligiga qarab, dozani 5-10 mg ga ko'paytiradi.

Barqaror gemodinamika bilan miokard infarktining o'tkir davrida quyidagi sxema bo'yicha uzoq vaqt ishlaydigan β-blokerlarni buyurish tavsiya etiladi:

Sol Metoprololi 0,1% 5 ml (5 mg) 0,9% NaCl eritmasida 1:10 suyultirilib vena ichiga asta-sekin fraktsion ravishda 2 minut davomida yuboriladi; 5 daqiqadan keyin takroriy 5 mg; keyingi 5 mg - yana 5 daqiqadan so'ng; Oxirgi dozadan 15 minut o'tgach, har 12 soatda og'iz orqali 25-50 mg dan ichiladi.

Miyokard infarktining o'tkir va subakut davrlarida quyidagi uzoq davom etadigan β-blokerlar qo'llaniladi.

Yorliq. 25 mg (50 mg) atenololi 1 tabletkadan kuniga 1 marta.

Yorliq. Bisoprololi 2,5 mg (5 mg, 10 mg) 1 tabletkadan kuniga 1 marta.

Yorliq. Nebivololi 5 mg 1 tabletkadan kuniga 1 marta.

Β-blokerlardan foydalanishga qarshi ko'rsatmalar mavjud bo'lsa, nogidropiridin kaltsiy antagonistlarini tayinlash ko'rsatiladi. Miyokard infarkti bo'lgan bemorlarda xavfsizligi tasdiqlangan yagona kaltsiy antagonistidir nisoldipin.

Yorliq. Nisoldipini 5 mg (10 mg) 1 tabletkadan kuniga 2 marta.

Va bu fibrinoliz tizimining muhim tarkibiy qismidir. Plazminogen faollashtiruvchisi, asosan, poydevor membranasini, hujayra ichidagi matritsani va hujayralarni ishg'ol qilishda ishtirok etadigan fermentlardan biridir. U endoteliy tomonidan ishlab chiqariladi va qon tomir devoriga lokalizatsiya qilinadi [Loscalso, ea 1988]. To'qimalar omili fosfolipoprotein. Ushbu kompleksning apoproteinlari molekula bo'lgan ajralmas membrana glikoprotein. og'irligi 46 kDa, bu endotelial, silliq mushak hujayralari, monotsitlar membranalarining fosfolipidlari bilan kuchli bog'liq. TAP in vivo-da bitta proteinli polipeptid (molekulyar og'irligi 72 kDa) bo'lib, proteoliz natijasida turli proteinazalar, shu jumladan plazmin, to'qima kallikrein va faollashtiruvchi X ga aylantiriladi. Ikki zanjirli TAP bir zanjirli prekursordan ko'ra faolroq. Angiotensinogenni Ang II ga konversiyalashda ferment ta'sirining pH tegishi kislotali hududda bo'ladi. TAP ni ang II hosil qiluvchi ferment sifatida ko'ring. Qonda aniqlangan TAP, turli stimullar bilan qon oqimiga kiritilgan endotelial faollashtiruvchidir. Qondagi TAP kontsentratsiyasi 6,6 +/- 2,9 ng / ml ni tashkil qiladi.

To'qimalar faktori - transmembran glikoprotein - II sinf sitokin retseptorlari oilasining a'zosi, ikkita mexanizm orqali hujayralarning faollashishiga olib kelishi mumkin.

To'qimalar omili, endotelial va silliq mushak hujayralarida lokalizatsiya qilingan qon ivishining tashqi mexanizmini faollashtirish tashabbuskori bo'lib, qon bilan aloqa qiladi va natijada trombin hosil bo'lishiga va qon ivish mexanizmining boshlanishiga yordam beradi. Bu qonda aylanib yuruvchi VII v. Ca ++ ionlari ishtirokida apoprotein T.f. f.VII bilan stoxiometrik kompleksni hosil qiladi, bu uning konformatsion o'zgarishini keltirib chiqaradi va Arg-152-Ile peptid aloqasini uzish orqali uni f.VIIa serin proteinaziga aylantiradi. Reaktsiya qonda aylanib yuradigan oqsilazalar miqdorini (f.Xa, trombin, f.VIIa, f.IXa) qo'zg'atadi. Olingan kompleks (ph.VIIa-T.f.) Ph.Ch.ni seriyali proteinaza F.Xa ga o'zgartiradi. VII to'qima faktor-faktor kompleksi X omilini ham, IX omilini ham faollashtira oladi, natijada trombin hosil bo'lishiga yordam beradi (Boyl, E.M., Verrier, E.D., ea., (1996)).

T.f.ning oqsil tarkibida. uchta domen mavjud: asosiy, hujayra membranasi yuzasida joylashgan, transmembran va sitoplazmatik. Ser-1-Glu-219 ning 219 aminokislota qoldiqlarini o'z ichiga olgan sirt maydoni retseptorlari funktsiyalariga ega. 23 a'zolardan iborat transmembranadan keyin sitoplazmatik "dum" kuzatiladi, uning yordami bilan oqsil membranaga biriktiriladi. Bu erda Cysning bitta domen qoldig'i membranali lipidlar (palmitat yoki stearat) bilan tiyotermik bog'lanishni hosil qilish imkoniyati yuzaga keladi. Alifatik aminokislotalar qoldiqlariga ma'lum bir rol yuklanadi, ularning yordami bilan oqsil membrananing ichki qatlamiga qo'shiladi va shu bilan to'qima faktor molekulasining "tutashishi" kuchayadi. Yuzaki domen uchta trionin qoldiqlarida glikosilatsiyalanadi (Thr-13, Thr-126, Thr-139). U 4 ta Cys qoldig'ini o'z ichiga oladi, ular ikkita disulfid aloqasini hosil qiladi, biri N-terminalda, ikkinchisi esa domenning C-terminal mintaqasida. Ushbu aloqalar mos keladigan peptid ilmoqlarini barqarorlashtiradi. S-terminal mintaqada joylashgan disulfid aloqasi funktsional ahamiyatga ega ekanligi, VII va VIIa omillarga nisbatan to'qima omilining kofaktor funktsiyalarini namoyon qilish uchun zarur bo'lganligi ko'rsatildi. Birlamchi tuzilishni tahlil qilish asosida disulfid aloqalarining joylashuvi va funktsional xususiyatlarini o'rganish, uning II sinfidagi sitokin retseptorlari oilasining Ifn-alfa va Ifn-gammaR interferonlari bilan homologiyasi aniqlandi. Qon ivish tizimida VII / VIIa omillarining retseptor - kofaktor - to'qima faktori bilan o'zaro ta'siri gemokoagulyatsiya tashqi mexanizmining faolligini bir necha ming marta tezlashtiradi. Ushbu tezlashishga erishiladi:

Birinchidan, qon ivishida VII / VIIa (VII faol) faktorli to'qima faktori majmuasini shakllantirish bilan boshlangan proteolitik mexanizm, bunda to'qima faktor VII / VIIa omil koeffaktori va modulyatori rolini o'ynaydi. VIIa omilining to'qima omiliga bog'lanishi hujayrada hujayralararo Ca2 + fosforillanib, mitogen faollashtirilgan protein kinazalarining (MAP kinazalari) - Erk-1, Erk-2, p38, Jnkni ko'payishiga olib keladi va odatda sitokinlar va omillar ta'sirida Egr-1 genining transkripsiyasiga olib keladi (erta o'sishga javoban). o'sishi.

Ikkinchidan, to'qima omilining sitoplazmatik sohasi o'zi hujayralararo signalda ishtirok etadigan proteolitik mexanizm orqali.

Ixtiro yangi plazminogen (yaxshilangan APT) bilan bog'liq bo'lib, organizmda yarim umri uzoqroq va issiqlik va kislotalarga nisbatan barqarorlikni oshiradi, bu esa tromb hosil bo'lishi atrofidagi yallig'lanishni bostirish uchun ishlatilishi mumkin. Ixtiro shuningdek rekombinant DNK texnologiyasidan va uni amalga oshirishda ishlatiladigan vositalardan foydalangan holda, to'qima plazminogen aktivatorini ishlab chiqarish usuliga tegishli. Ma'lumki, inson to'qimalarida plazminogen faollashtiruvchisi (APT) foydali fibrinolitik ta'sirga ega va fibrin bilan bog'langan plazminogenga qarshi juda samarali, tanadagi bo'sh qon aylanish fazasidagi plazminogen odatiy trombolitik moddalar, streptokinaza (SA) va urokinaza (UA) kabi faollashtirilmaydi. ... Odam tPT ning aminokislotalar ketma-ketligi va inson tPT-ni kodlovchi cDNKning nukleotidlar ketma-ketligi ma'lum (Pennica. D. va boshqalar, tabiat, 301, 214-221, 1983). Shuningdek, odam APT venoz va arterial qon quyqalarini eritib yuborishi ma'lum. Katta miqyosdagi klinik tadkikotlar davomida odamda APT vena ichiga o'tkir miokard infarkti bo'lgan bemorda okklyuzion koronar arteriya refüzyonunda samarali ekanligi ta'kidlandi. Ammo tromboz bilan bog'liq kasallikni davolashda ushbu preparatni qo'llashning noqulayligi uning qondagi fermentativ faolligining juda qisqa yarim umri (Rijken, DC va boshqalar, Tromb. Xemost. 54 (1), 61, 1985, Xubert, EF va boshqalar. al., Qon, 65, 539, 1985). Davolashda ishlatilganda, odamga APTni doimiy, yuqori dozali tomir ichiga yuborish kerak. Ma'lumki, tabiiy ravishda insonda uchraydigan TAP, molekulaning N tugmasidan boshlab, barmoq tanasi, EGF (epidermal o'sish omili) domeni, ikkita kringle 1 va kringle 2 domeni va serin proteaz domeridan iborat bo'lgan domen tuzilishiga ega. Rijken va boshqalarning ishlarida ta'kidlanishicha (Rijken DC va boshqalar. Tromb. Xemost., 54 (1), 61, 1985) inson TAP ning qisqa biologik yarim umri insonning TAP-ning barcha sohalari bilan bog'liq bo'lishi mumkin, ammo serinli domen bundan mustasno. -qiymatlar. Zonneveld va boshqalar. (Zonneveld, AJV va boshqalar, Prok. Natl. Akad. AQSh., 83, 4670, 1986), shuningdek, barmoq osti qismi, EDF domeni va kringle 2 domeni tabiiy ravishda paydo bo'ladigan inson TAP ning fibringa ulanish faoliyati uchun muhim bo'lishi mumkinligini ta'kidladi. shuningdek APT ning fibringa bog'liq aktivatsiyasini saqlab qolish uchun. Ammo, odamda tabiiy ravishda uchraydigan APT mavjud bo'lgan fibringa bog'lovchi faollikni va uning fibringa bog'liq faolligini saqlab qolish, shuningdek biologik yarim umrini uzaytirish bo'yicha aniq choralar ishlab chiqilmagan. Yaponiyaning Patentli Laid-Ochiq № 48378/1987 Patent "1 kringle" o'chirilgan, tabiiy ravishda uchraydigan inson TAP ning 87-175 aminokislotalarini yo'q qilish orqali olingan dasturni ochib beradi. Ushbu APT epidermal o'sish faktori mintaqasida qo'shimcha induktsiya qilingan nuqta mutatsiyasi bilan ajralib turadi. Yapon patent arizasi o'zgartirilgan APT fibringa bog'lanish qobiliyatiga ega ekanligini, ammo to'qima plazminogen aktivator inhibitori bilan o'zaro ta'siri susayganligini aniqladi. EP 241208 insonda tabiiy ravishda uchraydigan TAP ning 92-179 aminokislotalarini yo'q qilish natijasida olingan TAP-ni ochib beradi, bunda "1-kringle" ham o'chirildi. Ushbu ishda APT fibrinolitik ta'sirga ega ekanligi ta'kidlanadi. Bundan tashqari, EP 231624 modifikatsiyalangan APTni uzoq umr ko'rish davriga ega. F-EGFK2-A ketma-ketligi bilan o'zgartirilgan TAP kredle 1 domeniga ega emas, ammo uni tayyorlash uchun aniq usul ko'rsatilmagan. Yuqoridagilardan kelib chiqqan holda, ixtiroga muvofiq o'zgartirilgan TAP tabiiy ichki TAPdan uning ichki domenlari mintaqasida aminokislotalar ketma-ketligi bilan farq qilishi kerakligi tushuniladi. Keng qamrovli tadqiqotlar natijasida talabnoma beruvchi yaxshilangan APT oldi, unda barmoq domeni, EEG domeni, kringle 2 domeni va serin proteaz domeni mavjud, ammo birinchi "kringle 1" domeni ma'lum bir saytda o'chiriladi va domenlarni bog'laydigan sayt. Kringle 2 va serin proteazasi mutatsiyaga uchradi, natijada issiqlik va kislotalarga juda yaxshi qarshilik ko'rsatadigan TAP yaxshilaydi, biologik yarim hayot va kuchli yallig'lanishga qarshi faollik mavjud bo'lib, tabiiy ravishda uchraydigan inson TAP ning kerakli xususiyatlarini saqlab qoladi. Ixtiro takomillashtirilgan APT bilan bog'liq. APT ixtiroga ko'ra uning kimyoviy tuzilishida tabiiy ravishda paydo bo'ladigan odam APTdan keskin farq qiladi va yaxshi xususiyatlarga ega. Ixtiroga ko'ra takomillashtirilgan TAP bu FIGda ko'rsatilgan umumiy formulada ko'rsatilgan aminokislotalar ketma-ketligiga ega polipeptid. 28-29, bu erda R to'g'ridan-to'g'ri bog'liqlik, Y - A-Ile-B (A - Arg yoki Glu va B - lys yoki Ile), yaxshisi Glu-Jle-Lys. H 2 N - aminokislotalar, va -COOH - karbonli terminallar). Ixtiroda "takomillashtirilgan TAP" atamasi TAP-ning analogini bildirish uchun ishlatiladi, unda A va B mos ravishda quyida keltirilgan aminokislotalar mavjud:

Murakkab APT (II): Arg, Lys;

Murakkab APT (V): Arg, Ile;

Yaxshilangan APT (VI): Glu, Lys;

Murakkab APT (VIII): Glu, Ile. Ixtiro, shuningdek, tavsiya etilgan DNK usullaridan foydalangan holda APT ning taklif etilayotgan analogini ifoda etishga yo'naltirilgan. Yaxshilangan APT va rekombinat DNK ifoda vektorlarini kodlovchi yangi DNKlar bunga aloqador. 1 va 2-rasmlarda takomillashtirilgan APT (II) -ni kodlovchi sintetik gen parchasini qurish uchun ishlatiladigan 16 oligodeoksinukleotidlarning ketma-ketligi ko'rsatilgan; 3 - 4-rasmlarda 1 - 2-rasmlarda keltirilgan 16 oligodeoksinukleotidlar yordamida qurilgan cheklash Bge 11 va Eco R1 bilan tugaydigan, takomillashtirilgan APT (II) ixtirosini qurish uchun sintetik genning bo'lagi ko'rsatilgan. 5-rasm - takomillashtirilgan APT (II) ni qurish usuli (rasmda qora maydon, soyali maydon va ochiq maydon APT oqsili yetarli darajada kodlanadigan mintaqani, propeptid uchun kodlangan mintaqani va transtranslanmagan mintaqani tegishlicha 6-rasm - sintetik gen parchasini tekshirish usuli. Dide Doksis usuli va 7-DEAZA usuli bilan DNK asoslarining ketma-ketligini aniqlash orqali IV blok. 7-rasm - hayvonlar hujayralarida pVY1 ifoda vektorini qurish va yaxshilangan APT DNKini pVY1 ichiga kiritish usuli; 8 - 13-rasm, takomillashtirilgan APT (II) kodlaydigan DNK ketma-ketligi. va yaxshilangan APT (V); 14-19-rasm - yaxshilangan APT (II) va takomillashtirilgan APT (V) uchun DNK ketma-ketligini kodlash natijasida olingan aminokislotalar ketma-ketligi; 20-rasm - cheklovchi fermentlar va plazmid pTPA 2 ning funktsional xaritasi. pBR322 vektoriga birlashtirilgan tabiiy APT genining Eko R1-Xho parchasi (1000 tagacha juft juftlik) darz ketgan joylar Eko R1 va Bam H1; 21-rasm - mp9 (takomillashtirilgan APT (II), genning BgL11-Xho 11 (taxminan 1500 tayanch juftligi) parchasiga ega, takomillashtirilgan APT (II), M13 mp9 ikki qatorli DNKga BamH1 ajratish joyida o'rnatilgan; 22-rasm - qaramlik ". Fibrin o'rnini bosuvchi (+ Fb) va yo'q (-Fb) mavjud bo'lganda S-2251 usuli bilan yaxshilangan APT (VI) va tabiiy ravishda yuzaga keladigan APT faolligi uchun doz-effekt; 23-rasm - yaxshilangan APT (VI) faolligining o'zgarishi va mahalliy. Vaqt o'tishi bilan quyon qonida APT; 24-rasm - issiqlik bilan ishlov berishdan keyin yaxshilangan APT (VI) qoldiq faolligining o'zgarishi; 25-rasm - limfotsitlarni faollashtiruvchi (LAF) APT (VI) inhibe qilish; 26-rasm - faollashtirish bilan. APT (VI) tomonidan yaxshilangan denatüre protein bilan; 27 - yaxshilangan APT (VI) ta'siri ostida denatüratsiyalangan oqsilning buzilishi. Rekombinant DNK va o'zgartirilgan hujayralarni ishlab chiqarish usuli quyida batafsil ko'rib chiqilgan. Yaxshilangan APTni olish usuli. Ushbu ixtiro TAP olingan ona TAP kodlovchi gen, Bowes inson melanoma hujayralaridan tayyorlangan cDNA bankidan ajratib olingan. Poly A + RNK Bowes inson melanoma hujayralaridan ajratilgan va saxaroza zichligi gradient santrifugatsiyasi bilan fraksiyalangan. Keyin oz miqdordagi fraksiyalangan poli (A) + RNK tanlanadi va tPT genini kodlaydigan mRNK fraktsiyasi tPT mRNKning o'ziga xos ketma-ketligini tan olishga qodir bo'lgan oligonukleotid zondidan foydalangan holda prehidridizatsiya usuli bilan aniqlanadi. TPT mRN ga boy ushbu fraktsiyani boshlang'ich material sifatida ishlatgan holda, yuqorida tavsiflangan tPT mRNKni aniqlash uchun kDNA banki tayyorlandi va tekshirildi. APT genining to'liq ketma-ketligiga ega bo'lgan biron bir klon ajratilmaganligi sababli, etishmayotgan baz ketma-ketligi kerakli genni olish uchun DNK sintezatori bilan sintezlanadi. Keyin kerakli gen saytga xos mutatsion indüksiyasi bilan quriladi. Eco R1-Xho 11 parchasi tabiiy ravishda APT genida uchraydi (1000 ta tayanch juftlik), uning bir qismi E \u003d R1 va BamH1 yorilish maydonlarida pBR332 vektoriga kiritilgan N \u003d terminalda o'chiriladi va pTPA2 olingan. E. coli-ni ushbu plazmidga aylantirish orqali olingan shtamm (E. coli HB 101 / pTPA2) P-9649 (FERM BP-2107) kirish raqami bilan Yaponiyaning Sanoat fanlari va texnologiyalari agentligining Fermentatsiya ilmiy-tadqiqot institutida to'plangan. PTPA2 plazmidining cheklash va funktsional xaritasi 20-rasmda keltirilgan. Yaxshilangan APT geni pVY1 plazmidiga kiritilgan. Plazmid pVY1 plazmidning PADV10 (Fine Chemikale dorixonasi tomonidan ishlab chiqarilgan) ning BamH1-Kpn1 qismini (taxminan 2900 tayanch juftligi) plazmid pAdD26SV (A) N 3 (N) ning Eko R1 hazm bo'lagi bilan bog'lash orqali olinadi (doktor Xiroshi Universitetidan olingan. Shunga ko'ra, ushbu vektor adenovirusning asosiy kech qo'zg'atuvchisi (Ad2), yaxshilangan APT va intron genlarini kiritish joyining yuqorisidagi SV40 qo'zg'atuvchisining transkriptsiyali nazorati ostida sichqonchaning dihidrofolatli reduktaza genining cDNA-sini, yaxshilangan APT va intron genlarini joylashtiriladigan joyning yuqorisidagi erta SV40 qo'zg'atuvchisini va genning quyi qismida joylashgan poliadenilatsiya ketma-ketligini o'z ichiga oladi. ixtironing boshqa mos keladigan ifoda vektoriga kiritilishi mumkin. Ifoda vektori transformatorlarni olish uchun mos keladigan xujayraga kiritiladi. Uy egasi hujayralari sifatida prokaryotik hujayralar, masalan, E. coli, Bacillus subtilis va boshqalar, eukaryotik mikroorganizmlar, masalan, xamirturush va boshqalar, shuningdek yuqori hayvonlarning hujayralari ishlatilishi mumkin. E. coli vakili sifatida K12 shtammiga tegishli JM109 shtamm, W3110, Q va boshqalar shtammlari ishlatiladi, Bacillus subtilis vakili sifatida BD170 shtammi, BR151 shtammlari va boshqalar ishlatiladi. Xamirturushdan, RH218 shtammini, SHY1 shtammini va boshqalarni ishlatish mumkin. xamirturush Saccharomyces cerevisiae. Ifoda qilish uchun odatda mezbon hujayralar va tartibga soluvchi ketma-ketlik bilan mos keladigan turdan olingan replikoni o'z ichiga olgan plazmid vektor yoki faj vektor ishlatiladi. E. coli uchun vektorga misollar, masalan, plazmidlar pBR322, pUC18, pUC19 va boshqalar. - fage, masalan, qt, Charon 4A va boshqalar, M13 fage va boshqalar. Bacillus subtilis uchun vektor sifatida pUB110 dan foydalanish mumkin. , pSA2100, va hokazo, YRp7, YEp61 va boshqalar xamirturush uchun vektor sifatida ishlatilishi mumkin. Vektor maqsadli oqsilni ifoda eta oladigan qo'zg'atuvchini olib yurishi kerak. E. coli yoki phage genini targ'ib qiluvchi sifatida, masalan, Lae, trp, tac, trc, pL va boshqalar foydalanish mumkin. Uy egasi sifatida rhesus maymun buyrak hujayralari, chivin lichinkalari, Afrika yashil maymun buyrak hujayralari, sichqoncha xomilalik fibroblast, xitoy hamster tuxumdon hujayralari, insonning xomilalik buyrak hujayralari, kapalak tuxum hujayralari, odamning bachadon epiteliysi kabi madaniyatli hayvonlar hujayralaridan foydalanish mumkin. hujayralar, inson miyeloma hujayralari, sichqoncha fibroblastlari va boshqalar. Vektor sifatida siz erta SV40 qo'zg'atuvchisini, eukaryotik gendan qo'zg'atuvchini olib yuradigan SV40 (masalan, estrogen bilan ishlaydigan ovalbumin geni, interferon geni, glyukokortikoidni keltirib chiqaradigan tirozin aminotransferaza geni, timidin, gemidin va timidin) foydalanishingiz mumkin. , fosfogliserat kinaz geni, β-faktor gen va boshqalar), yirik papilloma virusi yoki ulardan kelib chiqqan vektorlar. Bundan tashqari, hujayralar tomonidan chiqariladigan va ishlab chiqarilgan TAP-lar ajraladigan joylar farqiga qarab har xil N-terminilarga ega ekanligi ma'lum. Sekretsiya va tPT ishlab chiqarishda kulturatsion hujayralarni uy egasi sifatida ishlatganda, signal peptidazasi yoki proteaz bilan parchalanish usuli hujayraning turiga qarab o'zgaradi, shuning uchun har xil N-terminiga ega bo'lgan tPT turlarini olish mumkin. Ushbu hodisa nafaqat madaniyatli hujayralar yordamida sekretsiya va ishlab chiqarish uchun yaroqlidir, chunki shunga o'xshash hodisa, masalan, E. coli, Bacillus sublit, xamirturush va boshqa modifikatsiyalangan boshqa hujayralar tomonidan APTni qabul qilishda ham yuz berishi mumkin. Xolaxon, Xanaxon, D.J.Mol usullari E.coli holatida yaxshilangan tPT geni bilan ifodalangan vektor yordamida xostni o'zgartirish uchun ishlatilishi mumkin. Biol., 166, 557, 1983), hayvonlar hujayralarini manipulyatsiya qilishda kaltsiy fosfat usulidan foydalanish mumkin (Vander Eb, A.J. va Grexem, F.L., Enrimologiyadagi uslub, 65, 826, 1980, Akademik matbuot) va boshqalar. Yuqorida aytib o'tilganidek, yaxshilangan APT tomirlarni ivish (hatto chuqur tomir), o'pka emboliyasi, periferik arterial tromboz, yurak yoki periferik arteriya kasalligidan emboliya, o'tkir miokard infarkti va trombotik xurujni o'z ichiga olgan turli xil kasalliklarni davolashda foydalidir. Tabiatda uchraydigan TAP kabi, takomillashtirilgan TAP ayniqsa o'tkir miokard infarktini davolashda foydalidir. Yaqinda tabiiy ravishda uchraydigan odamlarda uchraydigan APT, qon ivib qolgan koronar arteriyani tarqatishda, miyokardiyal perfuziyani tiklashda va ishemik miyokard qatlamining ko'p qismini 1 dan 3 soatgacha 30 dan 70 mg dozada vena ichiga yuborishda samarali ekanligi isbotlandi. Yaxshilangan APT qondagi biologik yarim umrni uzaytiradi va shuning uchun tabiiy APT bilan bir xil holatlarda samarali bo'ladi. Yaxshilangan t-PA tabiiy t-PAga o'xshash klinik ta'sirga ega bo'lishi mumkin, tabiiyki, inson t-PA uchun bitta dozada bo'lsa ham, tavsiya etilgan dozaning 10% atrofida. Bundan tashqari, ushbu ixtironing takomillashtirilgan TAP-lari quyidagi mahalliy xususiyatlarga ega bo'lib, ular mahalliy inson TAP va modifikatsiyalangan TAP-larga tegishli emas. a) Yallig'lanishga qarshi faollik. Trombus joylashgan joyda nafaqat trombusning o'zi shakllanishi, balki fibrinning parchalanish mahsulotlari yoki kinin miqdori izlari ham aniqlanadi. Ma'lumki, bu moddalar yallig'lanishni keltirib chiqaradigan ta'sirga ega va shu bilan tromblar hududida yallig'lanishni keltirib chiqaradi. Shu sababli, trombozni davolashda ishlatiladigan vosita nafaqat trombolitik faollikka, balki yallig'lanishga qarshi ta'sirga ham ega bo'lishi maqsadga muvofiqdir. O'tkazilgan tadqiqotlar natijasida, ariza beruvchi ikkita funktsiyaga asoslangan yaxshilangan APTga yallig'lanishga qarshi faollikni bera oldi. Ulardan biri shundaki, takomillashtirilgan APT yallig'lanish reaktsiyasining mediatorlaridan biri bo'lgan interleykin 1 (IL-1) ning biologik faolligini susaytiradi. Makrofag tomonidan ishlab chiqarilgan IL-1 gipertermiya, fibroblast o'sishini tezlashtirishi, sinovial hujayra membranasida kollagenaza ishlab chiqarishi yoki tomir endotelial hujayralarida prostatsiklin sintezini tezlashtirish orqali yallig'lanish reaktsiyasida ishtirok etadi deb ishoniladi. Shuningdek, IL-1 jigar hujayralariga ta'sir etib, yallig'lanish bilan kuchayadigan o'tkir davrda oqsillarni (zardob amiloid oqsili, fibrinogen va boshqalar) ishlab chiqarishni tezlashtiradi. Ariza beruvchisi takomillashtirilgan t-PA faolligini (LAF faolligi) inhibe qilishini aniqladi, bu esa IL-1 biologik faolligidan biri bo'lgan miyadagi timotsitlarning mitogen reaktivligini oshiradi. Yana bir funktsiya shundan iboratki, takomillashtirilgan APT trombus joyida yallig'lanish natijasida kelib chiqadigan denatüre qilingan protein (denatülenmiş immunoglobulin G, denatüre albumin va boshqalar) bilan yaqinlashadi va qo'shimcha ravishda ushbu denatüre protein tomonidan faollashtiriladi. Ushbu faollik tufayli, yaxshilangan APT yallig'lanish sohasidagi faqat denatüratsiyalangan oqsilni yomonlashtiradi va yallig'lanishni vaqtincha kamaytirish mumkin. Ariza beruvchi natriy dodecil sulfat gel elektroforez bilan yaxshilangan APT faqat denaturatsiyalangan oqsilni yomonlashishini tasdiqladi. Shakl ko'rsatilgandek. 26, yaxshilangan t-PA ning denatüratsiyalangan oqsil tomonidan faollashishi va tanlanishi aniq. HCl bilan ishlov berilgan immunoglobulin G va bir necha baravar past konsentratsiyada BrCN bilan davolash qilingan fibrinogen bilan bir xil faoliyat ko'rsatiladi. Boshqa tomondan, normal immunoglobulin C hatto 500 mkg / ml kontsentratsiyasida ham yaxshilangan APTga faollashtiruvchi ta'sir ko'rsatmaydi. Bloklangan qon tomirini qaytadan infuziya qilishdan keyin rezektsiyani oldini olish. Tabiiy APT bilan trombozni davolashda, okklyuzatsiyalangan qon tomirlari qayta tiklanganidan keyin reokslatsiya yuqori chastota bilan qayd etiladi. Shuning uchun trombotsitlar ivish inhibitori yoki antikoagulyant bilan kombinatsiyalangan terapiya o'tkaziladi. Shu bilan birga, kombinatsiyalangan terapiya dorilarning o'zaro ta'siri, dozani nazorat qilish, shunga o'xshash effektlar va boshqalarni o'z ichiga oladi. Afsuski, APT o'zi qo'shimcha ravishda antitrest reaktsiyaga qarshi ta'sirga ega. Ushbu ixtironing takomillashtirilgan Dasturi ikki turdagi faoliyat orqali qayta rezkulyatsiyaning oldini olish xususiyatiga ega. Birinchi tur - bu uzoq davom etgan harakat tufayli, yaxshilangan APTni kiritgandan so'ng, APT kontsentratsiyasining tez pasayishining oldini olish, bu Stuart-Xolms simptomining yo'q qilinishiga olib keladi va shu bilan qayta rekonstruktsiya qilinishining oldini oladi. Ikkinchi tur shundaki, IL-1 qon tomir endotelial hujayralariga zarar etkazilishining oldini olish bilan trombotsitlar koagulyatsiyasi bilvosita inhibe qilinadi, bu reokklyuziya paydo bo'lishining oldini oladi. c) ortib borayotgan barqarorlik. Proteinli preparatlar odatda barqaror emas, shuning uchun preparatlarni muzlatilgan quruq holatda yoki past haroratlarda eritma sifatida saqlash tavsiya etiladi. O'tkir miyokard infarkti bo'lgan bemorga plazminogen aktivator yuborilganda, o'limni kamaytirish uchun protsedurani hujum boshlanganidan keyin bir necha soat ichida bajarish kerak. Bunday holda, xona haroratida saqlanishi mumkin bo'lgan barqaror formulalar maqsadga muvofiqdir. Bundan tashqari, ortib borayotgan barqarorlik issiqlik bilan ishlov berish, kislota bilan ishlov berish va hk tayyorgarlik ko'rish paytida. Xususan, ushbu kashfiyotning hujayra kulturalari tomonidan ishlab chiqilgan takomillashtirilgan APTga kelsak, isitish uchun beqaror deb nomlanuvchi hujayra kelib chiqqan retrovirusni olib tashlash mumkin bo'ladi. Quyida ixtiro batafsilroq misollar bilan tavsiflangan, ammo u bilan cheklanmagan. Agar boshqacha ko'rsatilmagan bo'lsa, rekombinant DNK laboratoriya ko'rsatmalariga muvofiq ishlab chiqariladi. Maniatis T va boshq., Molekulyar klonlash: Laboratoriya qo'llanmasi, "Sovuq bahor porti" laboratoriyalari, "Sovuq bahor porti", Nyu-York (1982). Misol 1. APT DNKni klonlash. Bowlardagi odam melanoma hujayralari (Doktor Roblin, R. Saratonni o'rganish bo'yicha Milliy Institutda sotib olingan, AQSh) Opdenakker va boshqalar usuli bo'yicha etishtirilgan. (Opdenakker, G. va boshq., Evr. J. Bioxim, 131, 481-487 (1983)). APT mRNKini qo'zg'atish uchun kultura aralashmasiga TFA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-atsetat) oxirgi aralashmasi 100 ng / ml ni tashkil qiladi va 16 soat davomida kulturatsiyalanadi. So'ngra, umumiy hujayrali RNK kulturalangan hujayralardan Freeman va boshqalarning o'zgartirilgan usuliga muvofiq chiqariladi. ((Okayama) Berqa DNK qo'llanmasi, 3-bet, 1985, Yupqa kimyoviy dorixonalar). Oligo-dT tsellyuloza ustunidan (Farmaktsiya Fine Chemicals tomonidan ishlab chiqarilgan) poli (A) + RNK barcha hujayrali RNKlardan ajralib chiqadi. Natijada taxminan 10 o hujayradan 400 mkg poli (A) + RNK olinadi. Ushbu poli (A) + RNK an'anaviy tarzda saxaroza zichligi gradient santrifugatsiyasi bilan fraksiyalangan. Parchalangan poli (A) + RNKning bir qismi olib tashlanadi va nuqta pichoqlarini gibridlash amalga oshiriladi (Perbal, B., Apricical Gube to Molekular Cloninq, 410, 1984, John Wiley and Sons, Inc) tAp mRNA uchun xos bo'lgan oligonukleotid zondidan foydalanib. Bu holda ishlatiladigan zond (Y probasi) "5" -GCNNGGCAAAGATGGCA-3 "Pennica va boshqalar tomonidan tasvirlangan ATP ketma-ketligida aminokislotalar qoldiqlarini +291 dan +297-ga kodlaydigan mRNK mintaqasiga qo'shimcha bo'lib, β-siyanofosfamidat usuli yordamida sintezlanadi. DNK sintezatori Model 380A (Amaliy Biosystems tomonidan ishlab chiqarilgan). DNK oligomerini sintez qilish, himoya guruhini ajratish, qatronlardan tozalash va tozalash DNK sintezatori Model 380A uchun qo'llanmaga muvofiq amalga oshiriladi. 5-sonli Y probining radiolabellantirilishi T4 polinukleotid kinazidan (Taka-Ra Shuzo Co., Ltd. tomonidan ishlab chiqarilgan) va - (32 P) ATP yordamida laboratoriya ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshiriladi. Y probasi asosan gibridlanadi. 20-30S poly (A) + RNK bilan (bu fraktsiya M fraktsiyasi deb ataladi) shablon yordamida M fraksiyasidan 10 mkg poli (A) + RNK olinadi; teskari transkriptaza yordamida 3 mkg ikki qatorli cDNK sintezlanadi (Biokimyoviy sanoat kompaniyasi tomonidan ishlab chiqarilgan, Ltd.) Gubler-Xoffman usuliga (Gubler, U. va Xoffman, BJ, Gen 25, 263, 1983) muvofiqlashtirilgan va Denq-Wu usuli bo'yicha (Denq-Wu (Denq) usuli bo'yicha deoksid C zanjirining 3 "-terminusida ikki qatorli cDNA ga qo'shilgan. , GR va Wu, R., Nuklein kislotalar Res., 9, 4173, 1981). Keyinchalik deoksikli C-zanjiri bilan kengaytirilgan ikki qatorli kDNK Sefaroz CL 4B (Fine Chemicals Pharmacy tomonidan ishlab chiqarilgan) da 500 moldan kam bazaviy juftliklarga ega bo'lgan past molekulyar og'irlikdagi nuklein kislotalarni olib tashlash uchun jel filtrlashdan o'tkaziladi. Keyinchalik, cDNA pBR322 bilan yuviladi (Bethesda Research tomonidan ishlab chiqarilgan), an'anaviy usuldan foydalangan holda, P 1 joyida deoksik G zanjiri mavjud. Yuvishdan keyin olingan aralash vakolatli E. coli HB101 hujayralarini (Takara Shuzo Co tomonidan ishlab chiqarilgan) aylantirish uchun ishlatilgan. , Ltd). Natijada taxminan 4000 mustaqil transformatordan iborat bo'lgan cDNA banki. Ushbu cDNA yuqorida keltirilgan Woods usuli bo'yicha Y probasi yordamida koloniyalarning gibridlanishiga duchor bo'lgan (Woods, D., Focus, 6 (3), 1, 1984), Bethesda Research Lab tomonidan ishlab chiqarilgan.) Y probasi bilan o'zaro aloqada bo'lgan klonlarni olish uchun. Klonlar orasida APT ning eng uzoq kDNKini o'z ichiga olgan pTPA1 kloni aniqlandi. Keyinchalik dideoksi usuli M13 faj vektori va 7-DEAZA usuli yordamida (Carlson, J., va boshqalar, J. Biotexnologiyasi, 1, 253, 1984) amalga oshiriladi (Mizusawa S., va boshq., Nukleis kislotalari Res., 14, 1319) , 1986). Natijada, pTPA1 plazmidida Pennica va boshqalar tomonidan tasvirlangan APT geni uchun T y + 441 dan A y + 2544 gacha bo'lgan asosiy ketma-ketliklar mavjudligi aniqlandi. 2-misol. Yaxshilangan ATP (II) qurilishi. 1-misolda ko'rsatilgan pTPA1 plazmidida N-terminal mintaqa kredle 1 domeniga ega bo'lmagan yaxshilangan APT (II) ni qurish uchun etarli emas. Shuning uchun yetarli bo'lmagan DNK segmenti yuqorida aytib o'tilganidek 380A DNK sintezatoridan foydalanib sintezlanadi (Applied Biosystems tomonidan ishlab chiqarilgan). Sintez qilingan oligomerning asosiy ketma-ketligi va to'liq sintezlangan ketma-ketlik FIGda ko'rsatilgan. 1-4. Ushbu oligomerlardan foydalangan holda takomillashtirilgan APT (II) ni loyihalashning o'ziga xos tartib-qoidalari FIGda ko'rsatilgan. 5-6. 2-1). IV blokning qurilishi (Bql II-Eco R1 bo'lagi, taxminan 480 bp). Shakldagi IV blokning bo'lagi. 5 quyidagicha olinadi. Birinchidan, laboratoriya ko'rsatmalariga ko'ra, sintetik oligonukleotidlarning har biri soat 40 dan 40 gacha, FIGda ko'rsatilgan 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 va 15. 1-2, har biri 50 mkol reaksiya eritmasida bir soat davomida 37 ° C haroratda 10 dona T4 polinukleotid kinazasi (Takara Shuzo Co., Ltd tomonidan ishlab chiqarilgan) bilan fosforlangan. Reaktsiya eritmasi fenol bilan ishlov beriladi. Etanol bilan yog'ingandan so'ng, cho'kmalar pasaytirilgan bosim ostida quritiladi va sterillangan distillangan suvda eritiladi. Har bir oligomerning 40 pmolini 150 mkl eritmada 6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM NaCl, 7 mM MgCl 2 va 0,1 mM EDTA eritmasidan o'tkazgandan so'ng, 80 o C haroratda 5 minut davomida, harorat 60 o C ni 5 minut va xona haroratida bir soat, I blokning tegishli bloklarida (oligomerlar 1, 2, 3 va 4), II blokda (oligomerlar 5, 6, 7, 8, 9 va 10) va III blok (oligomerlar 11, 12, 13, 14, 15 va 16) etanol bilan cho'kadi va pasaytirilgan bosim ostida quritiladi. Qoldiq 40 mkl steril distillangan suvda eritiladi. Reaksiya 400 ° mkl reaktsiya eritmasida 4 ° C da 15 soat davomida DNK bog'lash to'plamidan foydalangan holda amalga oshirildi (Takara Shuzo Co., Ltd tomonidan ishlab chiqarilgan). Etanol bilan yog'ingandan so'ng va pasaytirilgan bosim ostida quritgandan so'ng, cho'kindi teril distillangan suv bilan eritiladi: I bloki (1) holatida gel elektroforez an'anaviy usulda (laboratoriya qo'llanmasida) ajratilgan va tozalangan 5% poliakrilamidda (laboratoriya qo'llanmasida), 100 tagacha juftlik bo'laklaridan iborat. , va II (2) blokda va III (3) blokda bo'lsa, elektroforez 3% agaroza jelida (BRL tomonidan ishlab chiqarilgan LMP agarozda) amalga oshiriladi (laboratoriya qo'llanmasi) va taxminan 190 juftlik bo'laklari elektroelutatsiya bilan tozalanadi (laboratoriya qo'llanmasi). asoslar. Keyin, 0,1 mkg, 0,2 mkg va 0,2 mkg I bloklari bo'laklari mos ravishda yuqoridagi DNK ligasyon to'plamidan foydalanib bog'lanadi. Taxminan 480 taglik juftligidan iborat Bgl II-Eco R1 parchasini (blok IV) ajratib olish uchun gel elektroforez 1,5% miqdoridagi agarozda o'tkazildi. Keyin DNK elektroelutatsiya yo'li bilan agaroz gelidan ajratiladi. So'ngra ushbu DNK 100 mkl reaktsiya eritmasida 37 ° S haroratda bir soat davomida fosforlanadi va yuqoridagi T4 polinukleotid kinazasining 10 ta birligi yordamida fenol bilan ishlanadi, etanol bilan cho'kadi va pasaytirilgan bosim ostida quritiladi. Ushbu sintetik gen parchasi va blokning IV bazaviy ketma-ketligi M13 fag vektoridan foydalanib, dideoksi usuli bo'yicha tayanch tartib bilan tasdiqlandi. Aniq texnikalar FIGda ko'rsatilgan. 6. Yuqorida tavsiflangan Bgl II-Eco R1 blokli IV qismini M13 mp18 DNK bilan bog'lashdan so'ng (Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) cheklovchi ferment BamH1 fermenti bilan hazm qilingan (Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) va Eko R1 ( Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd tomonidan ishlab chiqarilgan, M13 sekvensiya to'plami (Taraka Shuzo K., Ltd tomonidan ishlab chiqarilgan) va 7-DEAZA sekvestridan foydalangan holda (Takara Shuzo Co., Ltd tomonidan ishlab chiqarilgan) foydalanilgan. Bgl11 cheklash fermenti ajratish joyi va BamH1 cheklash fermenti ajratilgan joyi (Bgl11 ajratish uchastkasining BamH1 bilan yopilgan uchi) izosizomerik tarzda bog'lanadi va bog'langan qismni cheklash Xho 11 fermenti bilan ajratish mumkin, natijada tabiiy Bam 11 yorilib ketadi. Baza ketma-ketligini aniqroq aniqlash uchun M 13mp18 fagma (IV blokni o'z ichiga olgan holda) E.cjli JM109 shtammini Messing / Messing J. usuli, Enzimologiyada metodlar bo'yicha, 101, 20-78 (1983) usulida yuqtirgan, shundan so'ng ikki qatorli DNK olinadi. (replikativ turi). Ushbu DNKni (50 mkg) cheklovchi Xho 11 (Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co tomonidan ishlab chiqarilgan) va Eko R1 fermentlari bilan ajratib bo'lgandan so'ng, 480 tagacha juftlik bo'laklarini (blok 4) ajratib olish uchun 1,5% agaroz gelida gel elektroforez o'tkazildi. Ushbu DNK elektroelutatsiya natijasida olinadi. Olingan DNKni M13mp19 DNK bilan bog'lashdan so'ng (Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd tomonidan ishlab chiqarilgan) Eco R1 va BamH1 fermenti bilan cheklangan fermentlar DNK ligasyon to'plamidan foydalangan holda yuqorida tavsiflangan usulda singdirilganidan so'ng, baza ketma-ketligi aniqlandi. Yuqorida tavsiflanganidek, ushbu ketma-ketlikni M13mP18 va M13mp19 yordamida ikkala DNKni ketma-ket aniqlash orqali aniqroq tekshirish mumkin. Bundan tashqari, tasvirlangan usul bilan ikki qatorli replikativ DNK M13mp19 (IV blok bilan) olinadi. Ushbu DNKni (50 mkg) cheklovchi Eco R1 va Xho 11 fermentlari bilan ajratib bo'lgach, gel elektroforez 1,5% agarozda, 480 tagacha juftlik parchasini ajratib (4-blok) ajratganda amalga oshiriladi. 2-2). V blokni izolyatsiya qilish (Eko R1-Bal1 parchasi, taxminan 1250 bp). Plazmid DNK 1-misolda olingan pTRA1 klonidan laboratoriya qo'llanmasida tasvirlangan usul bo'yicha, FIGda ko'rsatilgandek ko'p miqdorda ajratilgan. 5. 70 mkg bu DNK Bal1 (Takara Shuzo Co., Ltd tomonidan ishlab chiqarilgan) va Nar1 (Nirro Gene Co., Ltd tomonidan ishlab chiqarilgan) cheklovli fermentlar bilan hazm qilinganidan so'ng, Nar1-Bal1 parchasini ajratib turganda 0,8% agaroz gelida elektroforez o'tkazildi. (taxminan 1540 bp). DNK elektroelutatsiya bilan izolyatsiya qilingan. Eco R1 fermenti bilan ushbu DNKni qisman hazm qilishdan so'ng, Eko R1-Bal1 parchasini (taxminan 1250 taglik juftligi) ajratib, 0,7% agaroz gelida elektroforez amalga oshiriladi. DNK elektroelutatsiya bilan izolyatsiya qilingan. 2-3). IV blok va V blokdan takomillashtirilgan TAP (II) genini qurish. 5, takomillashtirilgan APT geni quyidagicha olinadi. 2-1 misolda olingan IV blokni (Bgl11-Eco R1 qismi, taxminan 480 bp) dopingdan so'ng, V blokini (Eko R1-Bal1 qismi, taxminan 1250 bp) to'plamdan foydalanib 2-2 misolida olish yuqorida tavsiflangan DNK doping uchun, doplangan mahsulot etanol bilan cho'ktiriladi. Kamaytirilgan bosim ostida quritilganidan so'ng, cho'kma odatdagi usulda Xho 11 cheklovli fermenti bilan hazm qilinadi. Keyin Bgl 11-Xho 11 parchasini (taxminan 1500 taglik juftlik, yaxshilangan APT geni) ajratib olish uchun 0,8% agaroz jelida elektroforez o'tkaziladi. Keyin DNK elektroelutatsiya bilan ajratiladi. Shu tarzda olingan APT genining (II) to'liq bazaviy ketma-ketligi FIGda ko'rsatilgan. 8-13. Ajratilgan aminokislotalar ketma-ketligi ham FIGda ko'rsatilgan. 14-19. 3-misol. Yaxshilangan APT V, VI va VIII uchun gen qurilishi. Yaxshilangan TAP V, VI yoki VIII genni qurish TAP (II) genini quyidagi nashrlarga tayanib amalga oshiriladi. Genetik konversiya saytga xos mutatsion indüksiyasi bilan amalga oshiriladi. Nashrlari: Zoller MJ va Smit M, Fermentologiyada uslub, 100, 468-500 betlar (1983), Zoller MJ va Smit. M. DNK, 3, 479-488 (1984), Morinaga, Y. va boshq. Biotexnologiya, 636-630 (1984 yil iyul), Adelman, J. P. va boshq., DNK, 2, 183- betlar. 193 (1983), 6. G13 Seienz Room Co., Ltd tomonidan nashr etilgan M13 navbati bo'yicha qo'llanma (puC). 3-1). Rivojlangan APT genini (V) qurish. A) O'chirish uchun M13mp19 (APT / P /) ni yarating. Yaxshilangan APT (II) ning gen qismi, 2, 2-3) da batafsil tasvirlangan, BamH1 cheklov fermenti va ishqorli fosfataza bilan ishlov berilgan M13mp9 ikki qatorli DNK bilan bog'langan (Takara Shuzo Co., Ltd tomonidan ishlab chiqarilgan). Zanjirli mahsulot vakolatli E. cjli JM109 hujayralarini (Takara Shuzo Co., Ltd tomonidan ishlab chiqarilgan) translyatsiya qilish uchun ishlatilgan. Rangsiz steril nuqta hosil qiluvchi har bir klon E. coli JM109 ni yuqtirish uchun ishlatilgan. Bir torli DNK madaniyatning g'ayritabiiyidan ajratilgan, va ikki qatorli (replikativ) DNK Messing usuli bo'yicha E.jjli hujayralaridan ajratilgan (Messing J., Fermentologiyada metodlar, 101, 20-78, 1983). Agar hosil bo'ladigan egri gel elektroforezida Pst1 fermenti bilan PST1 fermenti bilan hazm bo'lgandan keyin ushbu ikki qatorli DNKlarning xususiyatlarini tahlil qilganda, klapan mp9 (yaxshilangan tAP (II)) olinadi, bunda tAP (II) geni mp9 DNKga kerakli yo'nalishda kiritiladi (21-rasm). Ushbu DNKlarning bir qismini pst hazm qilish elektroforez bilan 0,8% agaroza jelida amalga oshiriladi, bu erda klon mp9 (yaxshilangan APT (II) 7300 bp, 840 bp, 430 bp va 80 bp, taxminan. Ushbu klonning bitta torli DNKi keyingi tajribada saytga xos mutatsiyani qo'zg'ash uchun ishlatiladi. B) Saytga xos mutatsiyani qo'zg'atishga qodir primerni sintez qilish. Kengaytirilgan APT (II) genida saytga xos mutatsiyani qo'zg'atish uchun ishlatiladigan sintetik oligonukleotid DNK sintezatori 380 A (Applied Biosystems tomonidan ishlab chiqarilgan) yordamida sianoetil fosfamidat usuli bilan sintez qilinadi. DNK oligomerini sintez qilish, himoya guruhini olib tashlash, qatronlardan tozalash va tozalash DNK sintezatori 380 A dan foydalanish bo'yicha ko'rsatmalarga muvofiq amalga oshiriladi. Muayyan saytdagi mutatsiyani qo'zg'atish uchun, saytga mutatsiyalarni keltirib chiqaradigan primer (1) va primer (2) olinadi. M13 faj vektoridan foydalangan holda dideoksi ketma-ketligi uchun (Karlson J. va boshq., Jurnal Biotexnologiya, 1, p. 253, 1984). Yaxshilangan APT (II) uchun aminokislotalar va nukleotidlarning ketma-ketligi berilgan. Mutatsiyani qo'zg'atishga qodir primer (1) chizilgan bazada yaxshilangan APT (II) gen ketma-ketligidan farq qiladi (1-jadvalga qarang). C) Saytga xos mutatsiyani induktsiya qilish. Quyida mutatsiyani yaratishga qodir primer (1), ya'ni yaxshilangan APT geni (IV) bo'lgan klonni yaratish usuli mavjud. 3.3-1-rasmda tasvirlangan bitta torli DNKni yumshatgandan (renaturatsiyadan) keyin A) klon mp9 (takomillashtirilgan APT (II) va primer (1) dan so'ng, renatürasyon mahsuloti ikki qatorli DNKga aylanadi va keyinchalik E. coli JM109 ga aylanadi. Rivojlangan astar yordamida DNK ketma-ketliklari yaxshilangan APT (II) uchun mutatsiyaga uchragan genni ajratib olish uchun, ya'ni yaxshilangan APT geni (V) ajratish uchun tekshiriladi va ushbu klonadan ikki qatorli (replikativ) faj DNK olinadi va takomillashtirilgan APT geni (V) olinadi. ) "5. - Sintetik oligomerning termik fosforillanishi. Maxsus mutatsiyani induktsiya qilish uchun DNK primeri (1) 2.2-1-rasmda keltirilgan usul bilan fosforlanadi.) DNE heterodupleksini tayyorlash. 0,5 mkg bitta torli DNK M13mp9 (takomillashtirilgan APT (II) )) va BamH1 cheklovchi fermenti bilan hazm qilingan 1,5 mkg M13mp9 ikki qatorli DNK 30 mkg eritmada 2 pm fosforitlangan astar (1) 10 mM Tris-HCl (pH) dan iborat eritmada isitilgan. 7,5), 0,1 mM EDTA va 50 mM NaCl, 90 ° C (2 min), 50 ° C (5 min), 37 ° C (5 min) va xona haroratida (10 min). Eritmaga 36 mkl 50 mM Tris-HCl eritmasidan (pH 8.0) 4 birlik Klenov fermenti, 7 dona T4 DNK ligazasi, 0,1 mM EDTA, 12 mM MgCl 2, 10 mM dityotreitol, 0,7 qo'shiladi. Astarning cho'zilishini rag'batlantirish uchun mM ATP, 0,07 dATP va dGTP, dTTP va dCTP ning har biri 0,2 mM. Aralash 20 o C haroratda 2 soat va 4 o C haroratda 15 soat davomida reaksiyaga kirishadi. Transformatsiya yuqorida tavsiflangan eritma va E. coli JM109 vakolatli hujayralari yordamida (Takara Shuzo Co., Ltd tomonidan ishlab chiqarilgan) lizis dog'lari paydo bo'lguncha amalga oshiriladi. Rangsiz nuqta ajratilgandan so'ng, fagga ko'payish uchun E. coli JN109 yuqadi. Keyin shablon bitta simli DNK har bir klonga nisbatan super g'ayritabiiy madaniyatdan olinadi. Ushbu bitta torli DNKlar ketma-ketlik uchun primer (2) yordamida, so'ngra poliakrilamid gel elektroforezidan foydalanib, dideoksi usulining faqat "T" reaktsiyalariga (3-2 misoldagi "A" va "T" reaktsiyalar) duchor bo'ladi. Quritgandan so'ng, jel radio autografiya yordamida tahlil qilinadi. Olingan natijalar asosida kerakli mutantlar ketma-ketligiga ega bo'lgan klon aniqlandi. Klon madaniyati supernatanti E. coli JM109 hujayralarini yuqtirish uchun ishlatilgan va bitta dog'ni ajratib olish uchun plastinkaga qayta joylashtirilgan. Olingan bitta nuqta ichidan bitta simli DNK yuqorida ko'rsatilgan usul bo'yicha ajratiladi. Ushbu DNKlardan foydalanib, birinchi navbatda, DNK asosi ketma-ketligini dideoksi usuli yordamida kerakli tayanch ketma-ketlikda mutatsiyaga uchragan klonni olish uchun sekvensiya astaridan (2) foydalanib aniqlanadi. Ushbu faj klonini E. coli JM-109 hujayralari bilan 2-misolda tasvirlangan Messing usuli yordamida yuqtirganidan so'ng, ikki qatorli DNK olinadi. Ushbu ikki torli DNK, Xho 11 cheklovli fermenti bilan ajratilgan, elektroforez 0,8% agaroz jelida parchani ajratib olish uchun (yaxshilangan APT genini o'z ichiga olgan 1500 ga yaqin tayanch juftlikdagi yaxshilangan APT (V) genida bajarilgan. Keyin DNK elektroelutatsiya orqali olingan. Bundan tashqari, dideoksi usuli ishlatilgan). Shunday qilib olingan DNKning to'liq bazaviy ketma-ketligi aniqlanadi, bunda DNK yaxshilangan tAP (V) geni bo'ladi, shu bilan olingan yaxshilangan tAP (V) genining to'liq bazaviy ketma-ketligi (ammo -35 dan -1 gacha bo'lgan signal peptidini o'z ichiga oladi) 11-13-rasmda ko'rsatilgan aminokislotalar ketma-ketligi 17-19.3-2-rasmda ko'rsatilgan. (VI) va (VIII) yaxshilangan APTlarning qurilishi. Texnikalar 3, 3-1 misolda tasvirlanganlarga o'xshash. Birinchidan, M13mp3 (takomillashtirilgan APT (II)) quriladi, so'ngra saytga xos mutatsiyani keltirib chiqarish uchun primerlar sintez qilinadi. Yuqorida aytib o'tilganidek, ushbu primerlarning asoslari ketma-ketligi yaxshilangan tAp (VI) va yaxshilangan tAp (VIII), 5'-uchidan fosforlangan astar (3) va 5'-oxiridan olingan fosforilatlangan (5) fosforilatlangan gen uchun ishlatiladi (qarang). yorliq. 2). Saytga xos bo'lgan mutatsion induktsiyasidan so'ng, to'liq bazaviy ketma-ketlik dideoksi usuli bilan aniqlanadi. Ular kerakli bazaviy ketma-ketliklarga ega ekanligi tasdiqlandi. Shunday qilib, takomillashtirilgan APT (VI) va takomillashtirilgan APT (VIII) uchun genlar olinadi. Keyin ushbu genlar 4 va 5-misollarda tasvirlangan protseduraga muvofiq pVY1 vektoriga birlashtiriladi. 4-misol. Yaxshilangan tAp (II) genini pVY1 vektoriga integratsiyalashtirish. 4-1) pVY1 vektorining qurilishi. PVY1 vektori shakl ko'rsatilgan. 7. A) pAdD26SV (A) N3 (N) va Eko R1 yorilish maydonchasini qurish. Birinchidan, pAdD26SV (A) N3 DNK (Tokio universitetida doktor Xiroshi Xanda tomonidan sotib olingan, Mo1, Ce 11 dagi tezislardan ma'lum). Biol, 2 (11, (1982))) Bgl11 cheklov fermenti bilan parchalangan (Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co tomonidan ishlab chiqarilgan) DNK an'anaviy tarzda Klenow fermenti yordamida aniqlanadi (Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) Fenol bilan ishlov berilgandan so'ng, etanol bilan yog'ingarchilik va pasaytirilgan bosim ostida quritgandan so'ng, cho'kmalar steril distillangan suvda eritiladi. ligasyon reaktsiya aralashmasini vakolatli E. coli HB101 hujayralariga aylantiradi (Takra Shuzo, Co. Ltd tomonidan ishlab chiqarilgan) Plazmid DNKlari tetratsiklin qarshiligini namoyish qiluvchi transformatorlardan tayyorlanadi. Natijada, cheklov fermenti BgL tomonidan yopilmagan DNKni olib yuradigan klon paydo bo'ladi. (pAdD26SV (A) N3 (N)) Elo R1 ferment fermenti bilan ushbu klonning DNKi odatiy tarzda DNK yuqorida ta'riflanganidek Klenow fermenti yordamida yaroqsiz holga keltirildi. Fenol bilan ishlov berishdan so'ng, etanol bilan yog'ingarchilik va pasaytirilgan bosim ostida quritgandan so'ng cho'kmalar distillangan steril suvda eritiladi. B) KPn 1-BamH1 parchasini (taxminan 2900 taglik juftlik) pKSV10 dan ajratish va to'mtoq uchlarni shakllantirish. KPn1 va BamH1 fermenti bilan pkSV10 DNK (Fine Chemicals Pharmacy tomonidan ishlab chiqarilgan) an'anaviy tarzda hazm qilinganidan so'ng, DNK T4 DNK polimeraza (laboratoriya qo'llanmasi, 114-112-betlar) yordamida to'mtoq tugadi. Keyin elektroforezni taxminan 2900 taglik juftligidan ajratib olib, 0,7% agarozli jelda o'tkazing. Keyin parcha DNK olish uchun elektrolizga uchraydi

C) pVY1 qurilishi. A) olingan DNK parchasini va B) olingan DNK parchasini bog'lashdan so'ng E. coli HB101 (yuqorida tavsiflangan) ning vakolatli hujayralari aylanadi. Plazmid DNK an'anaviy ravishda tetratsiklin qarshilik ko'rsatadigan transformatorlardan olinadi. Ushbu plazmidli DNKlarning bir qismini cheklovchi Pst1 fermenti bilan (Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd tomonidan ishlab chiqarilgan) hazm qilinganidan so'ng, elektroforez 1,0% agaroz jelida o'tkazildi. Natijada klon (plazmid pVY1) bo'lib, u 3400 taglik juftlik, 3200 tagacha va taxminan 1400 taglik juftliklari bilan tavsiflanadi. Ushbu E / coli HB101 kloni (pVY1 P-9625 (FEPM BP 2106) kirish raqami bilan Yaponiya Sanoat Fanlari va Texnologiyalari Agentligining Fermentatsiya Tadqiqot Institutiga topshirildi. 4-2) Rivojlangan APT (II) genini pVY1 vektoriga kiritish. 4-misolda olingan pVY1 plazmidining DNKini BgL 11 fermenti bilan an'anaviy usulda tozalagandan so'ng, amfosfataza ishqoriy fosfataza yordamida amalga oshiriladi (Takara Shuzo. Co. Ltd. tomonidan ishlab chiqarilgan). Keyin davolashni uch marta fenol bilan o'tkazing. Etanol bilan yog'ingandan so'ng va pasaytirilgan bosim ostida quritgandan so'ng cho'kindi steril distillangan suvda eritiladi. Ushbu DNKni BgL 11-Xho 11 parchasiga (3, 3-1 misollarda olingan taxminan 1500 taglik juftlik) bog'lab qo'ygandan va vakolatli E. coli HB101 hujayralari yuqorida tavsiflangan usul bo'yicha bog'lanish mahsuloti bilan o'zgartiriladi. Plazmid DNKlari tetratsiklinga chidamli transport vositalaridan an'anaviy usulda olinadi. Ushbu DNKlarni cheklovchi fermentlar bilan ajratgandan so'ng (BqL 11, Pst 1), tanlangan agaroz gel elektroforez namunasini tahlil qilish asosida tanlangan pVY1 vektorli APV (II) yaxshilangan klon tanlanadi. Birinchidan, bu DNKlarning bir qismi cheklash BqL 11 fermenti bilan hazm qilinadi, shundan so'ng BqL 11-Xho 11 fraktsiyasini BqL fraktsiyasida bog'lab turganda, 1500 bp bo'lgan fraktsiya guruhiga ega bo'lgan klonni olish uchun 0,8% agaroz gelida elektroforez amalga oshiriladi. 11 plazmid pVY1, Xho 11 va BqL 11 ning bog'langan qismini BqL 11 fermenti bilan kesish mumkin. Ushbu klonlarning plazmid DNKining bir qismi Pst1 cheklov fermenti bilan sindiriladi va DNK 0,8% agaroz gelida bir o'lchamdagi klonni olish uchun elektroforezga uchraydi. taxminan 3400 bp, ikki chiziq 2300 bp, bitta chiziq taxminan 1400 bp va 80 qatorga yaqin. Laboratoriya ko'rsatmalariga muvofiq ushbu klondan (pVY1-APT (II) plazmid DNK olinadi) 5-misol. Yaxshilangan APT (V), (VI) va (VIII) genlarni pVY1 vektoriga qo'shilish. PNY1 ning plazmidini DNK hazm qilish natijasida misolda (4-1), BqL 11 fermenti bilan, dehosforlanish oddiy ishqoriy fosfataza (Takara Shuzo, Co., Ltd tomonidan ishlab chiqarilgan) yordamida amalga oshiriladi, so'ngra fenol bilan ishlov berish (3 marta), etanol bilan yog'ingarchilik va pasaytirilgan bosim ostida quritish. Keyin cho'kindi steril distillangan suvda eritiladi. Ushbu DNKni BqLII-Xho 11, 2, 2-3) misollarda olingan 1500 ga yaqin tayanch juftlik parchalari bilan bog'langanidan so'ng, bog'lash mahsuloti yuqorida keltirilgan vakolatli E. coli HB101 hujayralarini o'zgartirish uchun ishlatiladi. Plazmid DNK an'anaviy usul bo'yicha tetratsiklin qarshiligini namoyish qiluvchi transformatorlardan olinadi. Ushbu DNKlarni cheklash fermenti BqL11 va Pstl bilan hazm qilishdan keyin agaroz gel elektroforez amalga oshiriladi. Agarozoz gelidagi ajralish xususiyatini tahlil qilib, klonlar tanlanadi, bunda yaxshilangan APT geni (V) kerakli yo'nalishda pVYI vektoriga kiritiladi. Birinchidan, ushbu DNKlarning bir qismini cheklash fermenti BqL11 bilan hazm qilishdan so'ng, klonlar olish uchun 0,8% agaroz gelida elektroforez amalga oshiriladi va taxminan 1500 bp dan iborat tasma olinadi. BqL11-Xholl parchasi pVYI vektorining BqL11 qismi bilan bog'langanida, Xholl va BqL11 bir qismi yuqorida aytilgan izoschisomer konfiguratsiyasi tufayli BqL11 cheklov fermenti bilan ajratilishi mumkin. Pstl fermenti bilan ushbu klonlarning plazma DNK qismini qisqarganidan keyin elektroforez taxminan 3400 taglik juftligini, taxminan 2300 taglik juftligini, taxminan 1400 taglik juftligini tashkil etuvchi klonni olish uchun elektroforez 0,8% ga teng agaroz jeli bilan amalga oshiriladi. , bitta bo'lak 800 bp va bitta bo'lak 80 bp. Klon (plazmid pVYI-APT (V)) yordamida plazmid DNK laboratoriya rahbarligi asosida ko'p miqdorda olinadi. Xuddi shunday, takomillashtirilgan APT (VI) va (VIII) genlar pVYI vektoriga birlashtirilgan. 6-misol. CHO hujayralarida rivojlangan ATPni ifodalash. Plazmid pVYI - yaxshilangan APT (VI), APT (II), APT (V) yoki APT (VIII) DHFR nuqsonli CHO hujayralarini (Urlaub va boshq., Natl., Acad. Scad, USA, 77 (7) o'zgartiradi. ), 4216-4224, 1980) kaltsiy fosfat usuli bilan (Graham va boshqalar.) , Virologiy, 52, 456, 1973). Metotreksat (MTX) ishtirokida selektiv muhitda (MEM A LPHA (-), GIBCO) olingan transformator kloni APT faolligini 50-100 birlik / ml darajasida namoyish etishi aniqlandi (fibrin / agaroz plitasi usuli bilan aniqlangan qiymat. quyida). Ushbu klon keyingi tadqiqotlar uchun ishlatiladi. Ishlab chiqarish muhiti sifatida 20 xalqaro birlik / ml (SIGMA) aprotinin bilan boyitilgan GIT vositasi (Huaco Pewe Chemical Industry Co., Ltd. tomonidan ishlab chiqarilgan) ishlatilgan. 7-misol. Yaxshilangan APTni CHO hujayralarining super g'ayritabiiy ta'siridan tozalash. 6-misolda olingan super g'ayritabiiy madaniyat qisman antinAA monoklonal antikor bilan yaqinlik ustunida tozalanadi. Monoklonal antikor keltirib chiqaradigan gibrid odatdagi tarzda inson melanoma hujayralaridan olingan APT uchun tayyorlanadi. Antikor ishlab chiqaruvchi gibrid sichqonlarga kiritiladi va astsitlarda ishlab chiqarilgan monoklonal antikor (subglass: IgGM1) Selülofin Protein A (Biokimyoviy Sanoat Co., Ltd tomonidan ishlab chiqarilgan) va biokimyoda ishlab chiqarilgan monoklonal antikorlarni tozalash uchun MAPS tampon tizimi yordamida qazib olinadi va tozalanadi. Antikor CN3r faollashtirilgan Sefaroza (Farmaktsiya Fine Chemicals tomonidan ishlab chiqarilgan) an'anaviy ravishda bir ml gel uchun 4 mg nisbatda bog'langan. Antikor jeli (24 ml) to'rt litr kulturali supernatant bilan aralashtiriladi. Kechasi 4 ° C haroratda silkitgandan so'ng, jel ustunga (diametri 1,5 sm x 20 sm) o'rnatiladi. Keyin jel 125 ml har quyidagi eritmalar bilan ketma-ket yuviladi (1) Tris-HCl tampon pH 7.4 (bufer A) 25 IU / ml aprotinin (SIGMA tomonidan ishlab chiqarilgan) va 0,01% (v / v) Tween 80, (2) 0,5 M NaCl o'z ichiga olgan A buferi, (3) 4 M karbamidni o'z ichiga olgan A buferi va (4) A buferi. Yaxshilangan gel bilan bog'langan APT 0,2 M glisin-HCl tampon pH 2 bilan, 5 tarkibida 25 IU / ml aprotinin va 0,01% (v / v) Tween 80. Faol fraksiyalar tiklanadi va to'planadi. 10 mM Tris-HCl tamponiga qarshi pH 7.4, 25 IU / ml aprotinin va 0,01% (w / v) Tween 80 dan keyin, dializat vakuum markazdan qochirma kontsentrati bilan bir kechada 20-30 marta kontsentratsiyalanadi. VAC, SAVANT Inc. tomonidan ishlab chiqarilgan). 0,15 M NaCl, 25 IU / ml aprotinin va 0,01% (w / v) Tween 80 dan 10 mM Tris-HCl tamponiga, pH 7.4 ga nisbatan kontsentratlar yana bir marta dializlanadi va kechasi 80 ga qo'llaniladi. in vitro va in vivo baholari. Va nihoyat, o'ziga xos faollik 3700-5000 martaga oshadi va rentabellik APT faolligining 36 dan 42% gacha (fibrin / agaroz plitasi usuli bilan aniqlanadi). Ushbu faol fraktsiya natriy dodesil sulfat elektroforez va kumush bilan bo'yash orqali tahlil qilinadi. 54 kilodaltonda pasayish sharoitida bir nechta boshqa guruhlar bilan birgalikda juda kuchli guruh qayd etilgan. Keyinchalik, elektroforezdan keyin jel 2,5% (v / v) Triton X-100 bilan ishlov berilib, 37 ° C haroratda fibringa dastxat berish uchun fibrin / agaroz plitasiga joylashtirildi, shu bilan eritilgan tasma taxminan 50 kilodaltonda aniqlandi. Xuddi shu plitada, taxminan 60 kilodaltonda tabiiy TAP paydo bo'ladi. Natijalar shuni ko'rsatadiki, TAP antikorlarning yaqinlik ustuniga qo'shilgan va ushbu usul bilan ajratilgan, TAP ning yaxshilangan molekulyar og'irligi tabiiy shakldan 10 000 ga kam. 8-misol. Yaxshilangan APTning aniq faoliyatini o'lchash. Qisman tozalangan yaxshilangan TAP tarkibidagi oqsil miqdori zardob oqsili albuminidan foydalanib BradFord usuli bo'yicha (Bredford, anal. Bochem. 72, 248 (1976)) umumiy oqsilni o'lchash orqali aniqlanadi. APT antijeni miqdori ferment bilan bog'liq immunosorbent tahlil (ELISA) bilan o'lchanadi. Fibrinolitik faolligi fibrin / agaroz plitasi usuli va 125 1 yorliqli fibrindan tashkil topgan plyonkani eritib yuborish usuli bilan aniqlanadi. Fibrin / agaroz plitasi 95% koagulyatsiyalangan fibrinogenga agar qo'shib tayyorlanadi. 125 yorliqli fibrindan tashkil topgan plyonkani eritib yuborish usuli Hoyraeerts va boshqalarning tavsifiga muvofiq amalga oshiriladi. (J. Biol. Chem. 257, 2912, 1982) Bioscott Inc. tomonidan ishlab chiqarilgan inson melanoma hujayralaridan APT sifatida foydalangan. va Xalqaro APT Standartiga muvofiq standartlashtirilgan (Gaffuey va Kertis, Tromb. Haemostas, 53, 34, 1985). 125 1-fibrinli plyonkani eritib yuborish usuli va ferment bilan bog'langan immunosorbentli tahlil (ELISA) tomonidan aniqlangan antigen miqdori bo'yicha hisoblangan faollik qiymatidan 300000 dan 420,000 birlik / mg antijengacha bo'lgan faollik qiymati. 9-misol Fibrin uchun Advanced APT ning yaqinligi va Fibrin tomonidan faollashishi

Verheijen va boshqalar / EMBOJ, 5, 3525, 1986) ko'ra, yaxshilangan APT fibringa yaqinligi tekshiriladi. Kengaytirilgan yoki tabiiy ravishda paydo bo'lgan APT (1000 U / ml) turli xil konsentratsiyalarda fibrinogenga qo'shilib, undan so'ng trombonning bitta birligi qo'shilib, xona haroratida 3 minut reaktsiya qilinadi. Yaratilgan fibrin pıhtısı santrifüj bilan 8 minut davomida 16000 rpmda cho'kadi va fibrin bilan bog'liq bo'lmagan APT miqdori fibrin / agaroz plitasi usuli faolligini o'lchash yo'li bilan aniqlanadi. Natijada, takomillashtirilgan APT (VI) fibringa tabiiy shakl bilan bir xil bo'lganligi aniqlandi. Fibrinning bor yoki yo'qligida yaxshilangan APT tomonidan plazminogen faollashuv darajasini o'rganish uchun quyidagi tajriba o'tkazildi. Titrlash plastinkasidan foydalanib, tabiiy ravishda paydo bo'lgan yoki yaxshilangan APT 0,1 m Tris-HCl buferga, pH 7,5 ga qo'shiladi, uning tarkibida 0,3 mM sintetik substrat p-nroanilid tripeptid S-2251 (HD-Val-leulys-pNA) HCl, Kaby Inc. tomonidan ishlab chiqarilgan), 0,13 mkm plazminogen plazminogen, 120 mkg / ml DESAFIB ™ (Amerika Diagnostics Inc tomonidan ishlab chiqarilgan) va 0,1% Tween 80 umumiy hajmini 200 mkl. Tizim 37 ° S haroratda ushlab turiladi. Ma'lum vaqtdan so'ng, titrash (assimilyatsiya qilish) Titertech Multiscan 310 Modelidan foydalanib 405 nm o'lchanadi. Yaxshilangan APT (VI) va tabiiy ravishda uchraydigan APT ning amidolitik faolligi uchun dozani ta'sir qilish egri chizig'i FIGda ko'rsatilgan. 22. DESAFIB ™ qo'shilishi natijasida dozani ta'sir qilish eğrisi tabiiy TAP uchun 158 martaga, yaxshilangan TAP uchun esa 100 martaga to'g'ri keladi. Buning sababi, DESAFIB ™ preparati bo'lmaganda yaxshilangan APT (VI) faolligi tabiiy APT faolligidan 1/20 ga past. 10-misol. Quyonlarning qon oqimidagi fibrinolitik faollik uchun yaxshilangan APTni tahlil qilish. Tabiiy ravishda uchraydigan APT (n-APT) va ushbu quyondagi ushbu ixtironing yaxshilangan APT faoliyatini taqqoslash orqali farmakinetika. Shakl ko'rsatilgandek. 23, yaxshilangan APT faol holatda biologik yarim hayotning sezilarli darajada uzayishini ko'rsatadi (tabiiy APT yarim parchalanish davri 1-2 minutni ko'rsatadi, yaxshilangan APT esa biologik faol 8-15 daqiqa). Bundan tashqari, 5% faollik qiymati (administratsiyadan keyin 30 s 100%), yaxshilangan APTda saqlanganidan keyin 60 minut o'tgandan keyin ham saqlanib qoladi (tabiiy APT 0,1 ga teng. % boshlang'ich). Ushbu tajriba quyidagicha amalga oshiriladi

Sinov uchun 2,4 kg yapon oq quyoni tanlandi. Pentobarbital og'riqsizlantirish ostida APT periferik quloq venasi orqali amalga oshiriladi. Doza - quyon uchun 15400 dona (0,8 ml) yaxshilangan APT va 5400 dona (0,8 ml) n-APT (fibrin plastinka usuli bilan aniqlangan qiymatlar). Keyin, kateter yordamida turli vaqt oralig'ida (0,5 dan 60 minutgacha) femoral arteriyadan 2,5 ml qon yig'iladi va limon kislotasi natriyining (3,8%) 1/9 qismiga qo'shiladi. Qon yig'ilgandan keyin 30 minut ichida plazmani ajratib, past tezlikda santrifugatsiya amalga oshiriladi. Ajralgan plazma yordamida qonda APTning faolligi o'lchanadi. (1) APT faolligini o'lchash. 0,2 ml plazmani 3 mM muzli sirka kislotasi bilan 16 marta suyultirgandan so'ng, suyultirilgan mahsulot cho'kma olish uchun past aylanish tezligida santrifüjlanadi. Cho'kindi jinslar 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, eritmulin fraktsiyasini olish uchun plazma hajmiga teng bo'lgan 140 mM NaCl bilan eritiladi. APT faolligi ushbu euglobulin fraktsiyasining fibrin / agaroz plitasiga qo'shilishi bilan aniqlanadi. Plitani 37 soat davomida 16 soat davomida inkubatsiyadan so'ng, tPT faolligi blyashka sifatida kuzatiladi. Fibrin / agaroz plitalari usuli uchun standart egri hayvonga yuborish uchun ishlatiladigan APTni 0,1-10,000 birlik / ml ga suyultirish orqali olinadi. Shu tarzda aniqlangan qon APT faolligi 100% deb qabul qilinganidan keyin 30 sekund davomida qon to'plash natijasida olingan APT faolligi foizda ifodalanadi. 11-misol. Yaxshilangan APT (VI) ning issiqlik va kislotalarga chidamliligi. Issiqlikka chidamliligini aniqlash uchun yaxshilangan APT (VI) va tabiiy APT 100 mM NaCl va 0,01% Tween 80, pH 7,4 bo'lgan 50 mM Tris buferi bilan 100 mkg / ml kontsentratsiyasiga suyultirildi. Har bir eritma qaynab turgan suvda (harorat 98 o C) 2-60 daqiqa davomida saqlanadi. Sovutgandan keyin qoldiq faolligi fibrin plastinkasi usuli bilan aniqlanadi. Shakl ko'rsatilgandek. 24, yaxshilangan APT (VI) faolligining pasayishi tabiiy APT faolligining pasayishiga nisbatan ahamiyatsiz. Masalan, 2 minut issiqlik bilan ishlov berilgandan so'ng, tabiiy APTning faolligi 25% gacha kamayadi, yaxshilangan APT (VI) esa hanuzgacha 71% aktivligini saqlamoqda. Kislota qarshiligini o'rganish uchun yaxshilangan APT (VI) va tabiiy APT 0,5Nda eritiladi. 100 mkg / ml konsentratsiyasida HCl eritmasi, so'ngra xona haroratida 30 minut davomida turib olish. Neytrallashgandan so'ng, faollik fibrin-plastinka usuli bilan aniqlanadi. Yaxshilangan APT hech qanday o'zgarishlarni ko'rsatmaydi, tabiiy APT faolligi esa 50% ga kamayadi. 12-misol. Yaxshilangan APT (VI) yordamida limfotsitlarni faollashtiruvchi omilni inhibe qilish

Yaxshilangan APT (VI) va tabiiy APT PPM1 1640 to'qima kulturasi muhitida 7% homila buzoq zardobi va 58 mkM 2-merkaptoetanolni o'z ichiga oladi. 100 mkl suyultirish 96 ta yaxshi to'qima kulturasi plastinkasiga yuklanadi, undan keyin 4 dan 6 haftagacha bo'lgan C3H / He J sichqonlaridan erkak s3H / He J sichqonlaridan 50 mkl hujayra süspansiyonu (210 7 hujayra / ml) qo'shiladi. 1,2 mkg / ml), shuningdek 50 mkl IL-1 (4 dona / ml, Aenzyme Inc), so'ngra 5% karbonat angidridni o'z ichiga olgan 37 o C da inkubatorda 48 soat davomida etishtirish. Keyin H 3-timididin 0,5 mk konsentratsiyada qo'shiladi. kub. dyuym / 20 mkl / quduq. 18 soat davomida kultivatsiyadan so'ng, hujayralar shisha tolali filtrda yig'iladi va hujayralarga kiritilgan 3 H-timidin miqdori limfotsitlarni ogohlantiruvchi omilning faolligini aniqlash uchun suyuq sintilatsiya hisoblagichi bilan o'lchanadi. 25-rasmda ko'rsatilgandek, tabiiy APT limfotsitlarni rag'batlantiruvchi omilning faoliyatiga to'sqinlik qilmaydi va yaxshilangan APT uni sezilarli darajada susaytiradi. Faqatgina hal qiluvchi bilan sinovdan o'tkazilganda hech qanday ta'sir qayd etilmadi. 13-misol. Denatatsiya qilingan oqsilga qarshi harakatga asoslangan yallig'lanishga qarshi faoliyat. 1) Denatatsiya qilingan protein olish. Protein eritmasini (5 mg / ml) 0,1 N ga inkubatsiyadan keyin. HCl eritmasi yoki 0,1 N. NaOH eritmasi 37 o C haroratda 2-3 soat davomida oqsil eritmasi bir xil miqdordagi NaOH yoki HCl bilan neytrallanadi. 2) Yaxshilangan APT (VI) ning denatatsiya qilingan oqsilga yaqinligi. Usul: Quyidagi protsedura bo'yicha denatüre qilingan protein nitroselüloz plyonkasiga "yopishtirilgan". Keyin yaxshilangan TAP ning oqsil va nitroselülozli kino bilan o'lchanadi, shu bilan yaxshilangan TAP ning denatatsiya qilingan oqsilga qanchalik yaqinligi baholanadi. Nitroselüloz plyonkasi 20 mM Tris-HCl bufer eritmasiga, pH 7,5, 140 mM NaCl o'z ichiga oladi. Quritish. Denatürlangan protein (50 mkg / 10 mkl) nitroselüloz plyonkasiga tushiriladi. Quritish. 3% jelatin eritmasi bilan bloklash. Yig‘ish. Nitroselüloz filmining bir qismi yaxshilangan APT / 1 mkg / ml / eritmasiga botiriladi. Yig‘ish. Plazminogen va S-2251 sintetik substrati qo'shilib, 37 ° S da inkubatsiya qilinadi (so'rilgan yaxshilangan APT uchun miqdoriy tahlil). 405 nm da absorbsiyani o'lchash. Natija: 3-jadvalda ko'rsatilgandek, yaxshilangan APT HCl bilan ishlov berilgan immunoglobulin G, HCl bilan ishlov berilgan albuminlar va NaOH bilan ishlov berilgan albuminlarga bog'liqligini ko'rsatadi. Boshqa tomondan, yaxshilangan APT immunitetning buzilgan G va albuminlariga yaqinligini ko'rsatmaydi. 3) Yaxshilangan APT (VI) ni denatatsiya qilingan oqsil bilan faollashtirish. Usul: plazminogen (10 mkl ichida 0,0078 dona), 100 mkl 3 mM sintetik substrat S-2251 va har xil miqdordagi TBS buferi yaxshilangan APT aktivatorining reaktsiya eritmasiga qo'shiladi (denatüratsiyalangan protein, BrCN - davolash qilingan fibrinogen va boshqalar). 0,255 ml reaktsiya eritmasini olish uchun konsentratsiyalar. Reaktsiyani boshlash uchun reaktsiya eritmasiga takomillashtirilgan APT (25 mkl ichida 2,5 n / g) qo'shiladi. Muayyan vaqt davomida reaktsiyadan so'ng reaktsiyani to'xtatish uchun reaktsiya eritmasiga 2% natriy detsil sulfat (ekvolyum miqdor) qo'shiladi. Optik zichlikni (OD 405) o'lchash orqali yaxshilangan TAP faoliyati aniqlanadi. Natija: 26-rasmda ko'rsatilgandek NaOH bilan ishlov berilgan albumin va HCl bilan ishlov berilgan immunoglobulin G yaxshilangan APTning sezilarli faollashtiruvchi ta'sirini ko'rsatmoqda. Xususan, HCl bilan davolash qilingan immunoglobulin Gda faollashuv kuchli va HCl bilan ishlov berilgan immunoglobulin Gning faolligi BrCN bilan davolangan fibrinogenning faolligiga teng va bir necha baravar past bo'lgan konsentratsiyada. Buzilmagan albumin va immunoglobulin G faollashuvni ko'rsatmaydi. 4) APT (VI) yaxshilanishi bilan denatüratsiyalangan oqsilning emirilishi. Usul: Denatatsiyalangan oqsilning yaxshilangan APT bilan o'zaro ta'siridan so'ng, oldingi paragrafda aytilgan usul bilan bir xil sharoitda, reaktsiya tizimiga S-2251 sintetik substrati qo'shilmagan va denatatsiya qilingan protein miqdori 133 mkg / ml, elektroforezni ac-merkaptoetanol ishtirokida natriy detsil sulfat bilan poliakrilamid gelida o'tkazing. Natija: 27-rasmda ko'rsatilgandek, NaOH bilan davolash yoki HCL bilan muomalada bo'lgan oqsil rasmdagi effekti protein guruhlarining yo'q bo'lib ketishiga va uning buzilishini ko'rsatuvchi buzilish mahsulotlarining shakllanishiga olib keldi. Boshqa tomondan, buzilmagan albumin ishlatilganda, yaxshilangan APT bilan o'zaro ta'sirdan so'ng, biron bir o'zgarish aniqlanmadi, shuning uchun denatüre qilingan proteinning buzilishi topilmadi.

TALAB

P-da ko'rsatilgan aminokislotalar ketma-ketligiga ega rekombinant to'qima plazminogen aktivatori. bu erda Y - Glu-Ile-Lys;

H 2 N - amino terminali;

COOH - karboksilik;

R - bu to'g'ridan-to'g'ri bog'liqlik yoki shunga o'xshash ketma-ketlik, uning tarkibidagi o'zgartirishlar va / yoki o'chirish va / yoki faoliyatdagi o'zgarishlar bilan bog'liq bo'lmagan qo'shimchalar,

Va quyidagi xususiyatlarga ega: fibrinolitik faollik, plyonkani eritib yuborish usuli bilan aniqlanadi 1 2 5 I-fibrin, fibrin bilan faollasha olish qobiliyati va fibrin yo'qligida yaxshilangan tpA faolligi, tabiiy tpA faolligidan past bo'lgan, tabiiy shaklga, yarimparchalanishga, tabiiy tPA bilan taqqoslaganda, kislota va issiqlikka qarshilik, limfotsitlarni faollashtirish omilini inhibe qilish qobiliyati, denatüratsiyalangan oqsil bilan faollashish qobiliyati. 2. TPA analogini kodlovchi ketma-ketlikni o'z ichiga olgan rekombinant DNKga aylantirilgan hujayralar tarkibidagi rekombinat to'qima plazminogen aktivatorini ishlab chiqarish usuli va maqsad mahsulotni keyinchalik tozalash, bunda mezbon hujayralar DNK ketma-ketligini kodlovchi rekombinant vektorga aylantirilib, tpA ga muvofiq kodlangan. 1-band.