Dafnie jako testovací objekty v biologickém testu

Biotesting je metoda hodnocení kvality životního prostředí (toxicita látek) pomocí experimentů s testovacími objekty, přičemž určitý počet (obvykle 10) testovacích objektů je umístěn do přírodních vzorků vody a poté. Nějakou dobu je srovnáván s kontrolou. (Například, Daphnia: 4 dny jsou potřeba pro stanovení akutní toxicity, 20-24 dní pro chronickou toxicitu.) Vzorek spodního sedimentu je vysušen, je vyroben extrakt, pak je vše provedeno podle schématu s Daphnia.

Biotestování při hodnocení toxicity odpadních vod

Při testování toxicity odpadních vod není dovoleno odebírat jeden vzorek. Počet nezbytných porcí se volí na základě zkušeností s analýzou (podle pokynů a GOST), vzorky se obvykle odebírají každou hodinu denně, pak se vše důkladně promíchá a potřebné množství vody se odebere pro biotestování Vzorky odebrané ke studiu toxicity nelze zachovat. A tady je vše jako v první otázce: dvě banky se zkušební vodou a kontrolou

Biotestování při hodnocení toxicity chemických látek. Ukazatele toxicity (LC50, LD50 atd.)

Toxicita chemikálií je stanovena letální dávkou (pro teplokrevné testované objekty) a letální koncentrací (pro vodní). LC50 (konec roku) - takový konec in-VA, který způsobí smrt 50% testovací orm v určeném čase. Řasy se používají jako testovací objekty, nelze pro ně stanovit LC50, proto používají indikátor IC50 (inhibiční) pro zpomalení růstu kultury), aby se určila toxicita chemických látek, ředí se ve vodě v poměru 1/10,1,100,1/1000. Jsou odebrány 2 vzorky (banky) a kontrola. Po uplynutí stanoveného času jsou vzorky porovnány s kontrolou, takový konec je vybrán, aby bylo možné přesně stanovit LC50

Zkušební organismy používané při biotestování. Kritéria pro výběr zkušebních organismů

Zkušební objekt - organismus používaný k hodnocení toxicity látek, spodních sedimentů, vody a půdy. Jedná se o speciálně pěstovaný organismus v laboratorních podmínkách, s různou systematickou příslušností (potkani, řasy, prvoky, ryby). Požadavky na ně: geneticky homogenní (čisté linie), přizpůsobeno laboratorním podmínkám, v ideálním případě by reakce neměla záviset na sezónních a denních cyklech. Soubor testovacích objektů je stanoven metodami

Testovací funkce

Testovací funkce je kritérium toxicity používané při biotestování k charakterizaci reakce testovaného objektu na poškozující (negativní) účinek média. Například: úmrtnost / přežití (obvykle se používá pro prvoky, hmyz, korýši, ryby), plodnost / počet potomků, doba jejich výskytu, výskyt abnormálních odchylek, u rostlin - klíčivost semen, délka kořenů atd.

Hlavní kritéria pro hodnocení toxicity podle výsledků biotestování

Toxický účinek je změna všech životních funkcí pod vlivem toxických látek v závislosti na vlastnostech c. Po smrti ve vzorku<10% от контроля можно говорить о том,что среда не токсична.10-50% - среда безвредна.>  50% - životní prostředí je toxické

Odběr vzorků, přeprava vzorků, příprava na biotest

Aby bylo možné získat spolehlivé informace o toxických vlastnostech vzorku, musí být správně vybrány a uloženy, dokud není test dokončen. Pomocí mapy nebo schématu řeky vyberte umístění vzorkování (stanice). Pro přesnější hodnocení kvality vody na každé stanici se odebere několik vzorků. Vzorek se vymačká a převede do plastové nádoby. Vzorky vody se testují na biotest nejpozději 6 hodin po jejich odběru. Během dlouhodobé přepravy může teplota vzorku klesnout na +4 stupně.

Vlastnosti akutních a chronických biotestovacích experimentů

test akutní toxicity je vyjádřen při smrti organismů v určitém časovém období (pak několik sekund nebo několik dní). Chronická toxicita se objevuje až po několika dnech a zpravidla nevede k rychlé smrti těla, je vyjádřena v rozporu se životními funkcemi, výskytem toxikózy

TsOS PV R 005-95

Dokument byl vyvinut týmem autorů, který se skládá z: Rakhmanin Yu.A., Cheskis A.B. (vývojoví manažeři), Eskov A.P., Kiryanova L.A., Mikhailova R.I., Plitman S.I., Rogovets A.I., Tulakina N.V., Rusanova N.A., Doneryan L. G., Pozharov A.V.

V přílohách byly použity materiály Metodické příručky k biologickému testování vody RD 118-02-90 * a metodické dokumenty o používání zařízení BIOTESTER, jakož i „Metody kontroly toxicity jednorázových zdravotnických prostředků sterilizovaných metodou záření nebo plynu“ (Ministerstvo zdravotnictví SSSR, 1991). )

________________
* Níže uvedený dokument není poskytován. Pro více informací klikněte zde.

Předkládá: Technický výbor pro normalizaci TK-343 „Kvalita vody“

Předkládá: ministerstvo normalizace a certifikace potravinářského, lehkého průmyslu a zemědělské výroby Gosstandart Ruska

Schváleno: místopředseda Státní normy Ruska dne 12.10.95 pro zveřejnění a distribuci jako metodická referenční příručka.

Registrováno: Ústřední orgán pro certifikaci pitné vody, materiálů, technologických procesů a zařízení používaných v zásobování domácností a pitné vody N TsOS PV R 005-95

OBECNÁ USTANOVENÍ

OBECNÁ USTANOVENÍ

V podmínkách neustále rostoucího antropogenního znečištění vodních zdrojů závisí bezpečnost a neškodnost pitné vody dodávané obyvatelstvu vodárenskými podniky do značné míry na úplnosti, spolehlivosti a účinnosti kontroly kvality vody ve všech technologických souvislostech systému: v kontrolních úsecích vodních útvarů, v místech přítoku vody, v nádoby na čistou vodu po jejím čištění a dezinfekci, v distribuční síti vodovodů spotřebitelů. Současně se počet normalizovaných a kontrolovaných parametrů kvality, které společně určují bezpečnost a neškodnost vody, v posledním desetiletí více než zdvojnásobil a v souladu s doporučeními Světové zdravotnické organizace (WHO) zahrnuje více než 100 norem. Vysoká toxicita a odpovídající nízké maximální přípustné koncentrace (MPC) pro řadu těžkých kovů a většinu organických toxických látek významně komplikují analytické postupy chemické kontroly, vyžadují dlouhou dobu a velmi významné materiálové náklady na provádění komplexní kontroly kvality vody. Navíc ani úplná analýza kvality vody podle všech jednotlivých ukazatelů stanovených v regulačních dokumentech neumožňuje určit jejich složitý účinek na lidské tělo a přijetí systému sčítání relativních koncentrací plně neodráží mechanismus kombinovaného účinku toxických látek na stupeň nebezpečí vody spotřebované osobou.

V tomto ohledu lze spolu s tradičními metodami sledování kvality vody v systémech zásobování pitnou vodou použít biologické testovací metody založené na posouzení stupně nebezpečí vody z vodovodních zdrojů a pitné vody reakcí speciálně připravených živých organismů - testovacích objektů.

Zvláštností informací získaných pomocí biotestovacích metod je integrální povaha vnímání a odrazu všech toxických účinků v důsledku kombinace toxických látek obsažených ve vodě a složitých faktorů jejich společné přítomnosti.

Kromě toho by používání různých metod biotestování mělo být omezeno určitými podmínkami ve vztahu k cílům kontroly, místu odběru vzorků vody, stupni účinnosti atd., V závislosti na specifických vlastnostech každé konkrétní metody. Je možné komplexní použití různých biotestů, které se vzájemně vzájemně doplňují v citlivosti na různé skupiny toxických látek.

Ve všech případech nemůže použití biotestovacích metod nahradit analytickou fyzikálně-chemickou kontrolu zavedenou současnými regulačními dokumenty, avšak biotesty mohou významně doplnit své výsledky o posouzení komplexních účinků toxických látek obsažených ve vodě a zvýšit rychlost zjišťování nebezpečných úrovní kontaminace zdrojů pitné vody pro přijetí nouzových opatření. rezervní kapacita pro čištění nebo varování spotřebitelů a v některých případech také umožňují zvýšení periodicita odběru vzorků pro fyzikálně-chemické kontrole, a tudíž snížení nákladů na řízení v biotestu potvrzených udržování stabilní úrovně bezpečnostních ukazatelů surové vody ve zdrojovém vodě.

Tento dokument stanoví obecné pokyny pro uplatňování různých metod biotestování v centralizovaných systémech zásobování pitnou vodou pro řešení konkrétních úkolů sledování kvality vody ve zdrojích vody a čištěné vody dodávané spotřebitelům v kombinaci s tradičními metodami fyzikálně-chemické kontroly.

Metodická doporučení jsou určena pro použití vodárenskými a sanitárními podniky za účelem zlepšení systémů kontroly kvality vody, zvýšení její spolehlivosti a účinnosti a mohou být také využita orgány Státního výboru pro sanitární a epidemiologický dozor Ruska při výkonu dohledových funkcí nad kvalitou vody z vodovodních zdrojů a kvality pitné vody ke zvýšení spolehlivosti hodnocení bezpečnosti neškodnosti) regulované vody ve vztahu ke komplexním účinkům toxických látek v ní.

CHARAKTERISTIKA METODY BIOTESTINGU POUŽITÝCH PRO KONTROLU KVALITY VODY V EKONOMICKÝCH NÁPOJOVÝCH SYSTÉMECH

Hlavními charakteristikami metod biotestování, které určují cíle a podmínky jejich možného použití v systémech zásobování pitnou vodou, jsou:

- typ zkoušeného objektu;

- kontrolovaný parametr zkoušeného objektu (zkušební reakce);

- postupy pro měření zkušební reakce;

- odhadované standardy pro stanovení stupně nebezpečí kontrolovaného prostředí (vody) pro osobu podle naměřených parametrů zkušební reakce.

Ryby, korýši (dafnie atd.), Ciliati, zárodečné organismy, řasy, enzymy, bakterie atd. Mohou být použity jako testovací předměty v moderních metodách biotestování pro kontrolu bezpečnosti (neškodnosti) vody.

Hlavními požadavky na zkušební objekty jsou jejich dostupnost, jednoduchost a snadnost kultivace nebo skladování pro použití, dostatečná citlivost na toxické látky obsažené ve vodě, nebezpečné pro člověka.

Zkušební reakce zkoušeného objektu při vystavení toxickým látkám nebo jiným nepříznivým okolním faktorům může být vyjádřena smrtí zkušebních objektů (přežití), snížením rychlosti reprodukce, sníženou pohyblivostí nebo jinými charakteristikami chování typickými pro tento zkušební objekt, jakož i potlačením některých biochemických procesy probíhající v buňkách a enzymových systémech.

Hlavními požadavky na zkušební reakce při výběru metod biotestování pro praktické použití jsou přítomnost výrazné závislosti zaznamenaných odchylek od normy na koncentracích toxických látek ve vodě, jakož i možnost pozorování a zaznamenávání kvantitativních hodnot zkušebních reakcí s nezbytnou přesností a spolehlivostí pomocí dostupných nástrojů. ovládání.

Hlavními požadavky na postupy měření zkušebních reakcí při použití biotestovacích metod k řízení kvality vody ve vodovodních systémech jsou schopnost co nejdříve získat požadovanou „reakci“ na výskyt nebezpečných toxických látek ve vodě. To zpravidla vyžaduje použití speciálních regulačních zařízení s automatizačními prvky, které zajistí převod zaznamenaných testovacích reakcí na normalizované hodnoty charakteristik toxicity pro vodu.

Biotestovací metody, u nichž jsou postupy měření zkušebních reakcí navrženy na dlouhou dobu pozorování, mohou být ve fázi zkoumání a výběru zdroje dodávky vody pro účely pití a pití nebo při monitorování zdrojů zásobování vodou se zjevně stabilní kvalitou vody omezené.

Hodnotící standardy při používání biotestovacích metod by měly umožnit na základě získaných výsledků měření učinit závěr o stupni nebezpečí vody a přijetí nezbytných opatření, aby se zabránilo překročení možného ohrožení zdraví obyvatelstva, které konzumuje pitnou vodu z tohoto vodovodního systému, při překročení přijatelných norem pro riziko vody (toxicitu).

V současné době v současných regulačních dokumentech neexistují žádné schválené normalizované hodnoty maximálních přípustných komplexních toxických účinků měřených pomocí biotestů.

V tomto ohledu se pro každou konkrétní metodu biotestování na základě zvláštních studií stanoví korelace mezi pevnými hodnotami testovacích reakcí s možnými toxickými účinky na teplokrevné živočichy nebo s koncentracemi specifických toxických látek a na tomto základě se zavádějí určité odhadované hodnoty stupně toxicity (nebezpečí) regulované vody v závislosti na ze zaznamenaných výsledků měření během biotestování.

Je třeba mít na paměti, že tyto odhady nejsou kritérii pro nebezpečí nebo bezpečnost vody, pokud je osoba dlouhodobě používá k pití; mohou pouze naznačovat pravděpodobnost přítomnosti nebo nepřítomnosti nebezpečných koncentrací toxických znečišťujících látek ve vodě, což by mělo být potvrzeno výsledky odpovídající chemické kontroly, na jejímž základě se s ohledem na současné MPC vyvodí závěr o souladu pitné vody se stanovenými požadavky a její vhodnosti pro použití lidmi.

Ve srovnávacím plánu by se při posuzování například různých technologií úpravy vody, které zajišťují jeho soulad s regulačními požadavky pro určité typy toxických látek, měly upřednostňovat metody, které poskytují vyšší úroveň bezpečnosti určenou metodami biologických zkoušek.

Tabulka 1 ukazuje hlavní charakteristiky metod biotestů doporučených pro použití za účelem kontroly kvality vody v systémech zásobování pitnou vodou. Metody jsou popsány v referenčních aplikacích, jejichž číslování odpovídá počtu testovacích objektů v tabulce 1.

Tabulka 1

Testovací objekt	Testovací reakce	Metoda měření zkušební reakce	Standard (index toxicity)
1. Buněčný testovací objekt (zrnitý)   býčí spermie)	Změna mobility testovaného objektu	Výpočet počtu fluktuací intenzity rozptýleného záření způsobeného průchodem zkoušeného objektu optickou sondou pomocí automatického řídicího systému	Přípustné hodnoty indexu toxicity (poměr určených hodnot charakterizujících mobilitu zkoušeného objektu v experimentálních a kontrolních roztocích):%
2. Ciliates paramecium	Chemotaxní reakce - počet ciliatů, směrově se pohybujících   žijící v oblasti analýzy	Měření přístroji řady Biotester (například Biotester-2), zajišťující registraci testovacích reakcí s výstupem dat v libovolných jednotkách toxicity.	Přípustné hodnoty indexu toxicity (přípustný stupeň znečištění) :; vysoký stupeň znečištění:
3. Ciliates tetrachimena-   periformis	Změna míry přežití a reprodukce	Vizuální hodnocení (počítání) pod mikroskopem počtu testovaných objektů v určitých intervalech (15 minut, 1 hodina, 6 hodin, 24 hodin, 48 hodin).	Akutní toxický účinek - smrt 100% se zklidní do 6 hodin. Chronický toxický účinek s koeficientem toxicity (snížení počtu testovaných objektů ve srovnání s kontrolou během 48 hodin)
4. Kmen bakterií E-kolie	Změna úrovně dehydrogenázové aktivity mikroorganismů (potlačení aktivního enzymu)	Stanovení doby bělení methylenové modři jako nepřímého ukazatele aktivity enzymu dehydrogenázy.	Příznakem absence toxicity je odchylka doby bělení od kontrolního vzorku o méně než 15%.
5. Korýši   ny (daphnia, ceyodaphnia)	Změna míry přežití a plodnosti	Vizuální hodnocení (výpočet) počtu testovaných objektů v určitých intervalech ve srovnání s kontrolními vzorky.	Akutní toxický účinek - smrt více než 50% korýšů za 96 hodin. Chronický toxický účinek - významné snížení ve srovnání s kontrolou testovaných objektů do 20 dnů.
6. řasy (scénář, chlorella)	Snížení intenzity reprodukce (růst buněk řas)	Vizuální hodnocení (výpočet) zvýšení počtu buněk ve srovnání s kontrolním experimentem.	Ukazatel toxického působení - významné snížení koeficientu zvýšení počtu buněk ve srovnání s kontrolou po 96 hodinách (akutní toxický účinek) a po 14 dnech (chronický toxický účinek)
7. Ryby (guppies, zebrafish)	Snížené přežití	Vizuální hodnocení (výpočet) průměrného počtu testovaných objektů přežívajících ve zkušební vodě ve srovnání s kontrolním experimentem	Akutní toxický účinek - smrt 50% nebo více ryb za 96 hodin. Chronický toxický účinek - významné snížení přežití ryb během 30 dnů ve srovnání s kontrolním experimentem

Spolu s metodami uvedenými v tabulce 1 se používají speciální metody pro hodnocení kvality vody v systémech zásobování pitnou vodou, zejména pro stanovení celkové mutagenní aktivity pomocí biologických testovacích systémů po odpovídající přípravě. Při analýze pitné vody takový přípravek zahrnuje operace extrakce, koncentrace a sterilizace. K posouzení mutagenního potenciálu získaných extraktů se nejčastěji používá Amesův test (Salmonella / mikrozomy) a testy na indukci cytogenetických poruch (chromozomální aberace, mikronukleáry, výměny sesterských chromatidů). Popis těchto postupů je obsažen v „Pokynech pro experimentální hodnocení celkové mutagenní aktivity znečištění ovzduší a vody“ (Ministerstvo zdravotnictví SSSR, M., 1990). Složitost implementace těchto metod umožňuje jejich použití ve speciálních laboratořích výzkumného ústavu s potřebným vybavením a kvalifikovaným personálem.

Zejména se tyto studie systematicky provádějí ve Výzkumném ústavu lidské ekologie a zdraví životního prostředí pojmenovaném po A.N.Sysin RAMS.

VŠEOBECNÁ PRAVIDLA PRO APLIKACI METOD URČENÍ PRO MONITOROVÁNÍ KVALITY VODY V CENTRALIZOVANÝCH SYSTÉMECH HOSPODÁŘSKÉHO NÁPOJE

Kontrola kvality vody v centralizovaných systémech zásobování pitnou vodou zahrnuje výběr a analýzu vzorků vody v následujících základních prvcích technologického schématu:

- ve zdroji přívodu vody před přívodem vody;

- ve středních fázích procesu úpravy vody (technologická kontrola);

- v nádrži čisté vody a (nebo) z potrubí před jejich zavedením do rozvodné sítě vody;

- v systému zásobování vodou z distribučních kolon nebo kohoutků

Kromě toho ve velkých vodovodních systémech řídí vodárenská společnost povrchové zdroje dodávek vody vzorkováním v různých sekcích, obvykle v zóně hygienické ochrany.

Vzhledem ke specifičnosti metod biotestování, souvisejících s citlivostí většiny testovaných objektů na dezinfekční prostředky používané v procesu úpravy vody, a také vzhledem k vlastnostem jednotlivých metod biotestování s ohledem na načasování získání výsledků (možnost provedení expresní kontroly) a stupně univerzality při identifikaci různých typů toxikantů v tabulce. 2 poskytuje doporučení pro upřednostňované použití různých typů biologických zkoušek pro monitorování kvality vody v různých zařízeních a různých kontrolních bodech zásobování vodou.


Tabulka 2

Předmět kontroly	Kontrolní body
Zdroj vody	Kontrolní body v zónách hygienické ochrany
________________ * Dokument není platný na území Ruské federace. SanPiN 2.1.5.980-00 jsou platné dále. - Poznámka od výrobce databáze.
		2. Nepřetržitá provozní „Alyarmkontrol“ pro včasnou detekci náhlého výskytu nebezpečných koncentrací toxických látek ve zdroji vody, jejichž přítomnost vyžaduje zvláštní opatření pro další chemickou kontrolu, úpravu vody a (nebo) prevenci populace.
		3. Pravidelné monitorování ke stanovení stupně nebezpečí vody kombinovaným účinkem toxických látek v něm.
	vodní plocha	4. Nepřetržitě provozovaná automatická "kontrola poplachu"
		5. Pravidelné monitorování, aby se ověřilo, zda zdrojová voda splňuje obecné bezpečnostní požadavky
Pitná voda	před vstupem do distribučního systému vyčistěte nádrže na vodu a kontrolní body	6. Pravidelné sledování obecných toxických účinků toxických látek, které se mohou při čištění a dezinfekci vody (dezinfekční přípravky - organohalogenové sloučeniny atd.)
	zařízení pro odběr vody v síti přívodu vody	7. Pravidelné monitorování vzorků vody k potvrzení nepřítomnosti toxických účinků pitné vody po průchodu potrubím vodovodního systému.
Materiály používané v zařízeních, výrobcích a procesech		8. Potvrzení nepřítomnosti toxického účinku v důsledku vzájemného působení materiálů s vodou pro vydání povolení k použití materiálů (látek) v oblasti zásobování pitnou vodou

Kromě doporučení uvedených v tabulce 2 je třeba vzít v úvahu také některé z níže popsaných biotestových metod, které se týkají jejich citlivosti na jednotlivé skupiny toxických látek a možnosti porovnat zaznamenané výsledky testovacích reakcí s údaji ze standardizovaných metod chemické analytické kontroly.

Pro objekt buněčného testu (granulované sperma býka) byly experimentálně stanoveny korelační závislosti měřené testovací reakce na úrovni toxikometrických parametrů (- poloviční letální dávka pro krysy) a koncentrací široké škály organických toxických látek (chlorované uhlovodíky, fenoly, akrylamid, formaldehyd atd.), které se mohou zejména dostat do vody při kontaktu s polymerními materiály a produkty. Stanoví se mezní hodnoty indexu toxicity, při nichž laboratorní zvířata nereagují na určité toxické látky ve vodě v určitých koncentracích. Na tomto základě je tato metoda schválena Ministerstvem zdravotnictví Ruska pro posuzování polymerních materiálů používaných ve zdravotnických zařízeních. Byla také stanovena citlivost zkoušeného objektu na těžké kovy (rtuť, olovo, kadmium).

Pro biotestovací metody využívající ciliatů byly stanoveny údaje charakterizující obsah ve vodě a koncentraci řady organických a anorganických složek, ve kterých je zaznamenána zkušební reakce, která odráží akutní toxický účinek těchto složek. Na tomto základě lze tuto metodu doporučit zejména pro monitorování kvality vody ve vodních útvarech (zdroje vody), které mohou obsahovat toxické sloučeniny kovů (rtuť, chrom, kadmium, nikl, měď, zinek) a organické sloučeniny (chloroform) , benzen, akrylamid, vinylacetát, methylmethakrylát atd.).

Když byly jako testovací předmět použity enzymové systémy (hodnocení inhibice dehydrogenázy), poměrně vysoká citlivost testovacích reakcí na přítomnost zvýšených koncentrací iontů těžkých kovů (rtuť, olovo, měď, kadmium), jakož i na řadu organických sloučenin (fenoly, rezorcinol, hydrochinon atd.). Specifickým rysem při použití enzymových testovacích systémů namísto živých organismů je nedostatek citlivosti na respirační jedy (kyanidy), karcinogeny, jako je benzapiren, a také na některé anionty (dusitany, dusičnany).

Použití korýšů, řas a ryb v biotestovacích systémech k určení akutních a chronických toxických účinků regulované vody s odpovídající dobou trvání experimentů charakterizuje obecnou úroveň znečištění vody toxickými složkami a přítomnost nepříznivých faktorů ovlivňujících životní funkce organismů. S ohledem na citlivost na jednotlivé jedovaté látky jsou tyto metody relativně méně specifické ve srovnání s používáním například ciliatů, avšak při nebezpečných koncentracích ve vodě těžkých kovů (rtuti, chrómu atd.), Fenolů a jejich derivátů, některých vysoce toxických pesticidy a podobně

Při porovnání citlivosti biotestovacích metod s metodami analytického chemického stanovení jednotlivých chemikálií ve vzorcích regulované vody se zpravidla zaznamená nemožnost stanovení testovacích reakcí při nízkých koncentracích znečištění vody na úrovni MPC, které jsou kvantifikovány chemickými metodami.

Skutečně zaznamenané s nezbytnou spolehlivostí zkušební reakce v přítomnosti jednotlivých toxických látek ve vodě pro typické biotestovací metody v expresních kontrolních režimech jsou pozorovány při koncentracích výrazně vyšších než MPC.

Při použití biotestu s infusorií se tedy projevuje akutní toxický účinek při koncentracích niklu - 5 MPC, chrómu a kadmia - 10-20 MPC, chloroformu - 50 MPC, benzenu - 100 MPC, fenolu - 500 MPC. Výjimkou je rtuť, u které je zaznamenán akutní toxický účinek, je-li obsah 1–2 MPC.

To vše však platí pouze pro případy znečištění vody jednotlivými toxickými látkami a hlavní výhoda biotestovacích metod se projevuje ve fixaci kombinovaného účinku toxických látek přítomných ve vodě, kdy může existovat součet faktorů, které významně snižují detekční úroveň jednotlivých toxických látek. Současně možnost výslovné kontroly při použití metod biotestování s vhodným přístrojovým vybavením umožňuje rychle identifikovat výskyt mimořádných situací, kdy náhle vznikající vysoká úroveň znečištění vody nebezpečnými toxickými látkami může v krátké době poškodit zdraví obyvatelstva při konzumaci malého množství vody.

Souhrnné údaje o organizacích-vývojářích metod biotestu uvedených v tabulkách 1 a 2 a hlavní publikace o těchto otázkách jsou uvedeny v tabulce 3.


Tabulka 3

Metody NN podle tabulky 1 a testovací objekty	Rozvíjející se organizace a konzultanti	Literární prameny
1 buněčný testovací objekt (Granulované býčí spermie)	Všeruský vědecký výzkumný a zkušební ústav lékařské technologie (VNIIIMT), Moskva; JSC BMK-INVEST, Moskva	Kvantitativní expresní metoda pro hodnocení toxicity pitné vody, přírodních vod a průmyslových odpadních vod pomocí buněčného testovacího objektu. A.P. Eskov, R.I. Kayumov, Yu.S. Rotenberg Biotestování se suspenzí spermií „Nemoci z povolání a nemoci z povolání“ N 8, 1989
2 Ciliates of Paramecium	JSC "Quantum" St. Petersburg	Metodika stanovení toxicity vzorků vody expresní metodou na přístroji Biotester Vědeckého výzkumného ústavu hygieny a profesním adresáři Ministerstva zdravotnictví SSSR, Ld 1991 A. V. Pozharov, Yu.A Rakhmanin, S.A. Shelemotov. Aplikované aspekty instrumentálního biotestování vody. Hygiena a hygiena 1994
3 Infusoria tetrachymen periformis	Vědecký výzkumný ústav lidské ekologie a zdraví životního prostředí pojmenovaný po A.N.Sysin (NIIEChiGOS), Moskva	Metody biologického testování vody, Chernogolovka, 1988
4 kmenové bakterie E-collie (enzym dehydrogenáza)	Moskevský výzkumný ústav hygieny pojmenovaný po F.F.Erismanovi (MNIIG), Moskva	Maximální přípustné koncentrace škodlivých látek ve vzduchu a vodě. Referenční příručka, GIPH, L-d, 1972
5 korýšů (dafnie, ceriodafnie)	VNIIVODGEO, Moskva; Hydrochemical Institute, Rostov; Ústav biologie vnitrozemských vod, RAS (IBVV), Dubna; GUAC, Ministerstvo přírodních zdrojů Ruska, Moskva	Pokyny pro biotestování vody RD 118-02-09 * Goskomprirody SSSR, M., 1991 MS ISO 6341: 1989 „Kvalita vody. Stanovení inhibice mobility dafnie“
6 řas (scendesmus, chlorella)	Moskevská státní univerzita v Moskvě	Pokyny pro biotestování vody RD 118-02-90 Goskomprirody SSSR, M., 1991 MS ISO 6341: 1989 „Kvalita vody. Test inhibice růstu sladkovodních řas“
7 Ryby (guppies, zebrafish)	Výzkumný ústav mořských ryb (VNIRO), Rostov; Moskevská státní univerzita v Moskvě	Pokyny pro biotestování vody RD 118-02-09 Goskomprirody SSSR, M., 1991 M. N. Ilyin. Akvarijní chov ryb, M., ed. MSU, 1997
8 Salmonella (biologické testovací systémy pro stanovení mutagenní aktivity)	NIIEChIGOS pojmenovaný po A.N.Sysin, Moskva	V. V. Sokolovský, V. S. Zhukov, Yu.A. Rakhmanin, I. N. Ryzhova. Pokyny pro experimentální hodnocení celkové mutagenní aktivity znečištění ovzduší a vody, Ministerstvo zdravotnictví SSSR, M., 1990; A. M. Fonshtein, S. K. Abilev a další: Metody primární detekce genetické aktivity látek znečišťujících životní prostředí pomocí bakteriálních testovacích systémů; Metodické pokyny, M., 1985

DODATEK 1: BIOTESTING S POUŽITÍM TESTOVÝCH OBJEKTŮ CELL (granulované býčí spermie)

1. Princip metody

Princip metody je založen na analýze závislosti indexu pohyblivosti suspenze spermií na čase a stanovení potlačení jejich pohyblivosti (snížení průměrné doby mobility) pod vlivem toxických látek obsažených v regulované vodě.

Sperma může existovat mimo tělo v prostředích jednoduchého složení až několik hodin, aniž by se změnily jejich funkční vlastnosti.

Hlavním účelem zárodečných buněk jako nositelů dědičných informací je oplodnění vajíčka. Plnění této funkce je určeno jejich schopností postoupit na místo oplodnění, v důsledku čehož je mobilita hlavním ukazatelem fyziologického, biochemického a morfologického stavu spermií, což je velmi citlivé na účinky širokého spektra toxických látek.

Metoda je implementována pomocí automatického analytického systému (sady nástrojů), který poskytuje srovnávací hodnocení indexu motility suspenze spermatozo v experimentálních (testovacích) vzorcích vody a v kontrolních médiích, stanovení výpočtových postupů a vydávání výsledků ve formě odpovídajících indexů toxicity odhadovaných vzorků vody.

Index mobility () odhadovaný systémem je určen jako funkce koncentrace mobilních buněk a průměrného modulu jejich rychlosti

Kde je koeficient spojený s návrhem měřicího systému.

Index mobility se odhaduje automatickým výpočtem počtu fluktuací intenzity rozptýleného záření způsobeného průchodem buněk optickou sondou.

2. Testovací objekt

Bull test se používá jako testovací objekt. Sperma se získává na stanicích umělé inseminace ve formě granulí zmrazených v tekutém dusíku. Zmrazené sperma může být neomezeně dlouho skladováno v Dewarově nádobě s kapalným dusíkem.

Doplňování dusíku (4-5 litrů) se provádí každých 4-5 dní.

Variační koeficient koncentrace spermatu v granulích spermií nepřesahuje 10%, což poskytuje dostatečnou stabilitu a reprodukovatelnost v experimentech k posouzení jejich pohyblivosti v kontrolovaném vodném médiu.

3. Analytický systém

Analytický systém zahrnuje sadu nástrojů, které zahrnují analyzátor toxicity, jednotku pro přípravu vzorku a počítač s tiskárnou, které zajišťují automatické hodnocení kontrolované zkušební reakce, zpracování výsledků srovnávacího hodnocení mobility a vydávání konečných údajů ve formě odpovídajících výtisků.

Specifikace systému:

- vlnová délka laserového záření je 0,63 mikronů;

- výkon laserového záření - nejméně 1 mW,

- čas jedné analýzy - od 10 do 300 s v krocích po 10 s;

- doba cestování buňky (kapilární) se vzorkem - nejvýše 2 s;

- doba návratu vozíku - ne více než 15 s;

- teplota vzorků a pracovních vzorků - 35 - 45 ° С;

- přípustné odchylky od nastavené teploty - ± 1,5 ° C;

- objem buňky (kapiláry) s kontrolovaným vzorkem je 25 μl;

- Počítač typu IBM PC AT (a následující modely).

Blokové schéma systému je znázorněno na obr. 1

Složitý blokový diagram

Obr. Blokové schéma systému

1 - kapilára, 2 - podvozek, 3 - pohon, 4 - kapilární jednotka pro regulaci teploty, 5 - laserová, 6 - rozdělovací deska, 7 - mikro čočka, 8 - rozdělovač paprsků, 9 - obrazovka, 10 - maska, 11 - fotodioda, 12 - zesilovač, 13 - řadič, 14 - počítač, 15 - tiskárna, 16 - jednotka pro přípravu vzorků a pracovní vzorky

Konstrukce systému poskytuje možnost vizuálního pozorování buněčných testovacích objektů v zavěšení.

4. Pomocná zařízení, materiály, činidla

Mezi pomocná zařízení, materiály a činidla patří:

- sada kyvet (kapilár) pro umístění kontrolovaných vzorků do analytického systému;

- zkumavky s uzemňovacími zátkami podle GOST 1770-74 s objemem 3 - 5 ml - 40 ks;

- pipetové dávkovače s objemem 0,2 ml a 0,5 ml;

- odměrné baňky se zabroušovacími zátkami o objemu 1 000 ml - 2 ks;

- kónické baňky se zabroušenými zátkami o objemu 50 ml a 100 ml - 10 ks, každá s objemem 500 ml a 1 000 ml - 2 ks;

- torzní váhy typu VT-500;

- anatomická pinzeta;

- Dewarské plavidlo s kapacitou 26,5 l značky SDP-25 - 2 ks;

- Dewarské plavidlo s kapacitou 5 l značky SDS-5 - 1 ks .;

- sušicí skříň;

- lednička pro domácnost;

- býčí sperma v granulích zmrazených při teplotě kapalného dusíku;

- kapalný dusík;

- krystalický citrát sodný, chemicky čistý;

- krystalická glukóza;

- ethylalkohol;

- destilovaná voda;

- bidistiláty.

5. Podmínky a postup biotestu

5.1. Teplota pracovního média během biotestování by měla být udržována v rozmezí 40 ± 1,5 ° C. Toho je dosaženo automatickým termostatickým zařízením.

5.2. Testování

5.2.1. Zapněte analytický systém stisknutím spínače „Síť“ 30 minut před zahájením testu. Pomocí počítače se stanoví podmínky testu: teplota, čas jedné analýzy, počet kyvet (kapilár) se vzorky. Zobrazí se informace o dosažení požadované teploty a připravenosti systému k provozu.

5.2.2. Připravte experimentální a kontrolní roztoky. Jako kontrolní roztok se používá glukózo-citrátové médium prostředku: glukóza - 4 g, citrát sodný - 1 g, destilovaná voda - 100 ml. Kontrolní médium je také ředidlem pro rozmrazování zmrazeného spermatu. Izotonie experimentálního (testovacího) roztoku (vzorky vody) se dosáhne přidáním suchých činidel: 4 g glukózy a 1 g citranu sodného na 100 ml vody. Místo destilované vody lze použít vzorek „pozadí“ vody ze zdroje se známými ukazateli chemického složení, které splňují bezpečnostní požadavky.

5.2.3. Do zkumavek se nadávkuje 1 ml kontrolního a zkušebního roztoku a umístí se do termostatu vody pro regulaci teploty při teplotě 40 ± 1,5 ° C.

5.2.4. K rozmrazení zmrazeného spermatu se do zkumavek (podle 5.2.2) odměří 0,5 ml ředidla a termostatuje se na teplotu 40 ± 1,5 ° C. Ochlazené anatomické kleště odstraní granule spermií z Dewarovy nádoby a rychle ji umístí do zahřátého roztoku. Každá granule se rozmrazí v samostatné zkumavce. Ihned po rozmrazení spermatu se obsah zkumavek nalije do jedné zkumavky a důkladně se promíchá. Směs se termostatuje při 40 ± 1,5 ° C.

5.2.5. Pracovní vzorky pro biotestování v analytickém systému se připraví přidáním 0,2 ml suspenze spermatu do každé zkumavky s kontrolními a testovacími roztoky (podle bodu 5.2.4).

5.2.6. Pro analýzy se pracovní vzorky ze zkumavek s kontrolními a testovacími roztoky (podle 5.2.5) přenesou do kapilár, které vykonávají funkce kyvet, a uzavřou se střídavým ponořením konců kapilár do parafinové lázně.

Kapiláry s pracovními vzorky se umístí na vozík a namontují se do pohonu analytického systému.

Pomocí počítače jsou identifikovány kapiláry a je zahájen proces akumulace experimentálních dat. Proces pokračuje, dokud není index mobility nulový ve všech kapilárách, a poté je matematické zpracování výsledků prováděno podle algoritmů implementovaných počítačovým programem podle metodických ustanovení uvedených níže.

6. Zpracování a vyhodnocení výsledků

6.1. V důsledku experimentu je v systému pro každý vzorek biologicky testovatelných roztoků (testované a kontrolní vzorky vody) zaznamenána závislost:

  kde je ukazatel mobility (podle nároku 1),

  - čas

7.6.2. Pro každou z těchto závislostí se vypočítá vážená průměrná hodnota doby mobility,

Kde je - hodnota indexu mobility,

  - současné číslo hodnocení indexu mobility.

6.3. U kontrolních a experimentálních vzorků vzorků se vypočte aritmetická střední hodnota a směrodatná odchylka, podle které se pak variační koeficient pro každý vzorek vypočítá podle vzorce:

Kde je standardní odchylka

  - aritmetická průměrná hodnota

V případě získání variačního koeficientu o více než 15% pro alespoň jeden ze vzorků opakujte experiment. Pokud je hodnota variačního koeficientu pro každý ze vzorků menší nebo rovna 15%, pak jsou výsledky kontroly považovány za spolehlivé.

6.4. Výpočet indexu toxicity se provádí podle vzorce:

Kde a jsou aritmetické střední hodnoty průměrné doby mobility pro experimentální a kontrolní vzorky vzorků.

6.5. Kritériem nepřítomnosti toxických účinků je zjištění hodnot v rozmezí hodnot od 70 do 130%.

PŘÍLOHA 2: BIOTESTING S POUŽITÍM PARAMECIUM INFUSORIES

1. Princip metody

Metoda biotestové analýzy vzorků vody je založena na schopnosti Paramecium caudatum - ciliatů boty (dále jen „ciliates)) vyhýbat se nepříznivým a život ohrožujícím zónám a aktivně se pohybovat po gradientech koncentrací chemických látek v příznivých zónách (chemotaxní reakce). Tato technika umožňuje rychle určit akutní toxicitu vodných vzorků.

2. Charakterizace testovaného objektu, pěstování a příprava kultury pro analýzu

2.1. Jako testovací předmět se používá Paramecium caudatum - ciliatorová bota. Patří do království protozoů (jednobuněčná zvířata) - prvoky, druh - Ciliophora. Infusoria je rozšířená ve sladké vodě. Tvar buňky je elipsoidní, rozměry - 200 x 40 mikronů. Hlavní potravou ciliatů jsou bakterie, kvasinky atd. Reprodukce ciliatů nastává dělením příčných buněk. V závislosti na podmínkách pěstování může být doba generování od několika hodin do několika dnů.

Ve srovnání s jinými skupinami prvoků mají ciliati nejsložitější strukturu a vyznačují se řadou funkcí. Ciliatové jsou v nepřetržitém pohybu. Jeho rychlost při pokojové teplotě je 2,0 - 2,5 mm / s. Pohybová cesta je složitá: pohybuje se dopředu a otáčí se podél podélné osy těla pomocí řasinek, jejichž počet dosahuje 10 až 15 tisíc. Buňky vnímají změny vnějších podmínek (teplota, chemické složení média, elektromagnetické vibrace a další faktory) a první odezvou je změna povahy pohybu: snížení nebo zvýšení rychlosti, frekvence zastavení a zatáčky, různé taxíky, například geo, magnet, aero -, chemotaxe.

2.2. Zdrojový materiál pro kultivaci kultury ciliatů se přenáší po dodání zařízení BIOTESTER-2. Kulturu lze také získat ze sbírek kultury prvoků dostupných v různých vědeckých organizacích (například na BiNII SPb GU: 198904; Old Peterhof, Oranienbaumskoye Shosse, 2). Můžete odlišit svou kulturu od místních nádrží nebo od akvaristů, ale je třeba mít na paměti, že druh může určit specializovaný protozoolog, protože existují další zástupci rodu Paramecium caudatum.

2.3. Kultura

2.3.1. V této technice lze použít infusoriovou kulturu pěstovanou podle různých metod, která poskytuje testovaný objekt, jednak v množství dostatečném pro analýzu, a za druhé, citlivou na toxický model v koncentracích specifikovaných v bodě 2.3.

Kultivace se provádí v jakýchkoli vhodných nádobách, například ve skleněných lahvích, sklenicích, Petriho miskách a dalších. Jako krmivo se používají bakterie, kvasinky a jejich směsi pěstované sterilní na pevném médiu. Pokud neexistují podmínky pro pěstování sterilního krmiva, můžete použít pekařské droždí sušené na vzduchu.

Obecná ustanovení o pěstování plodin zahrnují povinný požadavek na identitu pěstitelského média a média, které bude použito k promytí kultury z metabolických produktů, získání pracovní suspenze, ředění vzorků vody a dalších postupů s kulturou.

Níže je uveden příklad kultivační metody infusoria.

2.3.2. Způsob pěstování ciliatů

Suspenze ciliatů v médiu Lozin-Lozinsky v množství 100 ml s hustotou 1 000 ± 200 buněk / ml se zavede do 200 ml kónické baňky se širokým hrdlem. Kvasnice se suší na vzduchu jako krmivo v množství 1 mg na 1 ml média. Kultivace se provádí při teplotě 18 až 26 ° C.

Pro biotestovou analýzu se kultura používá na začátku stacionární růstové fáze. Ke kontrole vývoje populace se denně odebere vzorek, ve kterém se stanoví počet buněk podle bodu 2.3.4.1. Absence buněčného růstu v populaci naznačuje začátek stacionární růstové fáze, denní sledování vám umožňuje určit jeho začátek. Obvykle za podmínek specifikovaných na začátku této sekce začíná stacionární fáze růstu po dobu 2-3 dnů, zatímco hustota kultury bude 4000 ± 1000 buněk / ml.

2.3.3. Údržba a skladování kultury

Během přestávek v biotestových analýzách stačí udržovat kulturu pouze jako semeno. Jeden způsob, jak to udržet, je na rýžových zrn. 2-3 Petriho zrna se umístí do Petriho misky, přidá se asi 30-40 ml média a ciliates boty se umístí v množství 50-100 buněk / ml. Jednou za 2 týdny se mění prostředí a rýžová zrna.

Je vhodné uchovávat kulturu zálohování ve zkumavkách. Jednou za 7 až 10 dnů se buněčný koncentrát z horní části zkumavky (bez míchání) nalije do další zkumavky, do předchozího objemu se přidá médium L-L a 0,5 mg kvasinek na 1 ml kapaliny.

Dalším způsobem uchování kultury je skladování v chladničce při nízkých pozitivních teplotách. Míra dělení může být jedna divize za 10-20 dní. Kultura se promyje z metabolických produktů a staré krmivo, koncentrace suspenze se upraví na 200 ± 100 buněk / ml, přidá se suché kvasnice 0,2 mg / ml a umístí se do chladničky. Takže kultura trvá až měsíc. Při použití kultury uložené v lednici je nutné počkat, až se její teplota vyrovná s teplotou jiných roztoků, a teprve poté provést nezbytné postupy.

Zvláštní pozornost by měla být věnována skutečnosti, že ciliator nevydrží náhlé změny teploty (!).

2.3.4. Stanovení koncentrace suspenze ciliatů

Koncentrace buněk musí být stanovena během kultivace kultury, při přípravě pracovní suspenze buněk a ke stanovení velikosti zkušební reakce. Bezproblémové stanovení koncentrace ciliatů se provádí pomocí odměrného přístroje řady Biotester.

2.3.4.1. V obecném případě je koncentrace infusorických buněk stanovena počítáním buněk pod mikroskopem podle metod obecně přijímaných v mikrobiologické praxi: pomocí měřicích sítí, počítání komor atd. Vypočítaný počet buněk se spočítá na jednotku objemu média a vyjádří se jako koncentrace (buňky / ml). Následuje příklad metody pro počítání ciliatů. Protřepejte počáteční suspenzi ciliatů a pipetou odeberte 0,5 ml suspenze. K tomuto objemu se přidá 9,5 ml 1% roztoku NaCI. Tímto způsobem je dosaženo imobilizace ciliatů. Bez čekání na úplné znehybnění ciliatů (přibližně po 2 až 5 minutách) se 0,5 ml zředěné suspenze odebere a tento objem se distribuuje ve formě 6 až 10 velkých kapek na suché sklo (například v Petriho misce). Pomocí mikroskopu (lupa) se ciliati počítají do všech kapek. Výsledek se převede na 1 ml původní suspenze.

Například: 0,5 ml suspenze imobilizovaných ciliatů je rozděleno do 6 kapek, ve kterých bylo spočítáno 29, 38, 32, 31, 28, 35 buněk - celkem 193. 38 ml buněk je obsaženo v 1 ml zředěné suspenze a 1 ml počáteční suspenze proto bude obsaženo 3860 ciliatů.

2.3.4.2. Specializovaným nástrojem pro stanovení počtu infuzí pohyblivých buněk je přístroj řady Biotester. Stanovení koncentrace pohyblivých buněk se provádí podle dříve vytvořené kalibrační křivky.

Pro vytvoření křivky odstupňování se vezme suspenze ciliatů v médiu L-L podle bodu 2.3.2. Ze suspenze se připraví několik ředění, z nichž každé je dvakrát menší než předchozí koncentrace, objem suspenze každého ředění je alespoň 5 ml. Poslední ředění může obsahovat 5-10 kpetok / ml. Počáteční koncentrace buněk se stanoví počítáním počtu buněk pod mikroskopem (viz bod 2.3.4.1). Koncentrace buněk v řadě ředění se stanoví vhodným výpočtem. V tomto případě je koncentrace pohyblivých buněk ciliatů v počáteční pracovní suspenzi a ve všech ředěních stanovena postupně, přičemž se odečítají hodnoty na zařízení. Za tímto účelem naplňte kyvetu kontrolovanou suspenzí buněk na vrchol (neimobilizujte ciliaty!), Vložte ji do kyvetového modulu zařízení a proveďte řadu indikací.

Postup spočítání buněk v počáteční suspenzi, příprava ředění, měření na přístroji počáteční suspenze a ředění se opakuje nejméně třikrát a výsledky se zprůměrují. Podle získaných dat je kalibrační křivka konstruována jako závislost odečtů zařízení na logaritmu koncentrace buněk. Vynesená křivka může být po dlouhou dobu použita se stejným měřicím zařízením.

2.4. Příprava ciliatů pro analýzu

2.4.1. Kultura ciliatů pěstovaná v souladu s odstavcem 2.3 se promyje z metabolických a krmných produktů, koncentrace se upraví na pracovní hodnotu, připravenost kultury k analýze se kontroluje podle její citlivosti na toxickou látku modelu a podle schopnosti vstoupit do čistého vzorku.

2.4.2. Praní kultury

Při mytí se používá normální fyziologická reakce ciliatů, která se shromažďuje v horních vrstvách kapaliny. Použití cév s úzkým dlouhým hrdlem vám umožní soustředit ciliates v horní zóně a sloučit se do jiné nádoby s minimálním množstvím kontaminovaného kultivačního média. Koncentrát se zředí čistým médiem L-L, buňky se znovu shromáždí v horní zóně a vypustí. V důsledku promývání ciliatů by měl být stupeň ředění kultivační tekutiny čistým médiem alespoň 1: 200.

Příklad. Kultura byla pěstována na médiu L-L. Mycí prostředí - L-L. K 50 ml kultury přidejte 50 ml média L-L, opatrně nalijte do odměrné baňky o objemu 100 ml, nezapomeňte vyplnit krk. Po 5-15 minutách se ciliati shromažďují v horní zóně. Vypusťte horní část kapaliny z baňky. Suspenze buněk se získá zředěním kultivační tekutiny na polovinu a objemem například 20 ml. Promývací postup se opakuje ještě dvakrát přidáním 80 ml média L-L k suspenzi 20 ml a buněčná suspenze se získá například v objemu 10 ml se zředěním počáteční suspenze ciliatů 50krát. Objem získané suspenze se upraví (10 ml) a dosáhne se zředění 250krát. Koncentrace buněk ve výsledné suspenzi se stanoví podle bodu 2.3.4 a upraví se na hodnotu 1 000 ± 200 buněk / ml. Výsledné pracovní zastavení ciliatů po předběžné kontrole se používá po dobu 1,5 hodiny.

2.4.3. Zkontrolujte připravenost suspenze ciliatů k analýze

Kontrola se provádí podle dvou parametrů současně:

- stupněm výstupu ciliatů z kontrolního čistého vzorku;

- citlivost na toxický model.

2.4.3.1. Pro kontrolu výstupu ciliatů v kontrolním vzorku se podle článku 4.1 tři buňky suspendují se suspenzí buněk, vrstveného L-L média nebo zjevně netoxické vody (ale ne destilované). Po 30 minutách změřte koncentraci buněk v horních zónách kyvety podle bodu 4.2. Průměrujte výsledek na 3 kyvetách a stanovte připravenost zkušební kultury pro biotestovou analýzu podle podmínky: výtěžek by měl být alespoň 70% koncentrace pracovní suspenze.

2.4.3.2. Pro testování citlivosti na modelovou jedovatou látku se roztok síranu měďnatého o koncentraci 0,1 mg / l připravený podle bodu 3.4 navrství ve třech kyvetách. Po 30 minutách změřte koncentraci v horních zónách kyvety podle odstavce 4.2 a vypočtěte index toxicity pro roztok síranu měďnatého.

Pokud se kultura používá v biotestové analýze.

3. Měřicí přístroje, pomocná zařízení, materiály, roztoky.

3.1. Měřicí přístroje:

- binokulární mikroskop se zvýšením řádu 10-50;

- zařízení řady BIOTESTER, například BIOTESTER-2 - specializovaný pulzní fotometr podle TU 401-51-005-91 * se sadou fotometrických kyvet;
________________
* Níže uvedené TU nejsou uvedeny. Pro více informací klikněte zde. - Poznámka od výrobce databáze.

- laboratorní váhy pro všeobecné použití (GOST 8.520-84).

3.2. Pomocná zařízení:

- nádoby pro kultivaci z chemicky inertního materiálu, například kádinky, kuželové širokohrdlé baňky, Petriho misky (GOST 25336-82);

- pipety, odměrné baňky, zkumavky (GOST 20292-74, 1770-74).

3.3. Materiály:

- solná značka h.d. nebo chemicky čistý: chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, síran hořečnatý, kyselina uhličitá, pentahydrát síranu měďnatého;

- polyvinylalkohol PVA - stupeň 11/2, prémium (GOST 10779-78);

- Suché pekařské droždí na vzduchu - používá se jako krmivo pro ciliaty.

3.4. Řešení:

- suspendace buněk ciliatů získaných pěstováním zkušebního předmětu za určitých podmínek (viz bod 2.3), promytého z metabolických produktů a krmiv (viz bod 2.4) a upraveného na pracovní koncentraci (hustotu) 1000 ± 200 buněk / ml;

- médium pro kultivaci a ředění: připravuje se na destilované vodě (médium Lozin-Lozinsky, dále L-L). Je možné použít vodovodní vodu, která by měla být řádně ošetřena (dechlorinát a stát po dobu 5-10 dnů).

Pro přípravu koncentrátu média L-L v 1 litru vody se rozpustí následující soli (stupeň analytické čistoty nebo čistý stupeň): NaCI - 1,0 g, KCI - 0,1 g, MgSO - 0,1 g, CaCIx2HO - 0,1 g, NaHCO - 0,2 g. Takový roztok může být uchováván v lednici až 7 dní. Pro práci se používá médium L-L, získané desetinásobným zředěním původního koncentrátu. Ředicí médium a kultivační médium by měly být identické a zajistit přežití ciliatů po dobu 5 dnů;

- toxický model založený na síranu měďnatém. Matečný louh síranu měďnatého (10 mg / l) v destilované vodě se neuchovává déle než týden. Před stanovením se připraví pracovní koncentrace síranu měďnatého. Solné roztoky s koncentracemi do 1 mg / l se připravují v destilované vodě a s koncentracemi 0,1 mg / l nebo méně v médiu L-L;

- PVA roztok v médiu L-L: 5% roztok se používá jako neutrální zahušťovadlo. Pro přípravu roztoku PVA se smíchá 0,5 g PVA prášku s 9,5 ml média L-L. Směs se zahřívá ve vodní lázni, dokud se prášek nerozpustí. Roztok používejte během dne.

4. Metoda stanovení

4.1. Metoda pro stanovení toxicity kapalných médií je založena na schopnosti testovaných objektů reagovat na výskyt látek, které jsou nebezpečné pro jejich život ve vodním prostředí, a je zaměřena na pohyb po koncentračním gradientu těchto látek (chemotaktická reakce) a vyhýbání se jejich škodlivým účinkům.

Chemotaktická reakce je realizována za předpokladu, že je k dispozici stabilní a reprodukovatelný gradient koncentrace chemikálií. Podobný gradient se vytvoří vrstvením suspenze ciliatů ve zahušťovadle vzorku zkušební vody ve vertikální kyvetě (zkumavce). V tomto případě se v měřicí buňce vytvoří stabilní hranice, která se udržuje po celou dobu biotestování. Toto rozhraní neinterferuje s volným pohybem ciliatů v jejich preferovaném směru, zatímco zabraňuje míšení tekutin ze spodní a horní zóny.

Po vytvoření dvou zón v kyvetě do 30 minut se ciliaté rozdělí do zón. Důležitým rysem behaviorální reakce ciliatů je masivní pohyb buněk do horních vrstev tekutiny. Pokud zkušební vzorek neobsahuje toxické látky, bude v kyvetě pozorována koncentrace ciliatů v horní zóně. Přítomnost toxických látek ve zkušebním vzorku vede k odlišnému charakteru redistribuce ciliatů v kyvetě, tj. Čím vyšší je toxicita vzorku, tím menší je podíl ciliatů do horní zóny (testovaný vzorek).

4.2. Kritériem toxického působení je významný rozdíl v počtu ciliatových buněk pozorovaných v horní zóně kyvety ve vzorku, který neobsahuje žádné toxické látky (kontrola), ve srovnání s tímto indikátorem pozorovaným ve zkušebním vzorku (experiment).

4.3. Kvantitativní hodnocení parametru zkušební reakce charakterizující toxický účinek se provádí výpočtem poměru počtu ciliatů pozorovaných v kontrolním vzorku a vzorku (podle bodu 8.1) a vyjadřuje se jako bezrozměrné množství - index toxicity (T).

5. Podmínky definice

5.1. Stanovení toxicity touto metodou provádí provozovatel s kvalifikací laboratorního asistenta.

5.2. Technika podléhá obecným bezpečnostním předpisům pro práci s chemikáliemi a laboratorními přístroji pro všeobecné použití (uvedenými v pasu přístroje).

5.3. Ciliates pracují v teplotním rozsahu 10 - 30 ° C, v souladu s požadavky bodu 2.3.

6. Příprava na stanovení

6.1. Vzorkování a skladování

Obecné postupy odběru vzorků jsou definovány v následujících dokumentech: ISO 5667/2. Kvalita vody. Vzorkování. část 2; GOST 24481-80. Pitná voda. Vzorkování.

6.2. Biologické testování vzorků vody se provádí nejpozději 6 hodin po jejich výběru. Pokud není možné provést analýzu v uvedeném čase, ochlazují se vzorky vody (+4 ° C). Konzervace vzorků pomocí chemických konzervačních látek není povolena.

6.3. Objem vzorku vody potřebný pro analýzu (trojmo) je asi 10 ml. Pro jedno stanovení stačí 2 ml.

6.4. Během biotestování by teplota zkušebního vzorku měla odpovídat teplotě suspenze zkoušeného objektu. Ciliates netolerují náhlé změny teploty (!).

6.5. Pokud jsou ve vzorku hrubé inkluze, které mají srovnatelnou velikost s infusorskou buňkou nebo jsou velké, je nutné vzorek filtrovat.

7. Testování

7.1. Příkopové plnění

Ke kyvetě se přidají 2,0 ml suspenze ciliatů v pracovní koncentraci předem testované podle dvou parametrů: citlivost na toxickou látku modelu (viz bod 2.4.3.2) a výstup do ředicího média (viz oddíl 2.4.3.1). K suspenzi se přidá 0,35 ml 5% roztoku PVA, vše se důkladně promíchá, aniž by došlo ke zvlhčení stěn kyvety, a 1,8 ml analyzovaného vzorku vody se navrství (například pipetou), aniž by se smíchalo se spodní vrstvou. Po 30 minutách (trvání zkušební reakce) se v kontrolních () a experimentálních () vzorcích postupně stanoví koncentrace ciliatů v horní zóně kyvety. Kontrolní a experimentální vzorky se připravují současně.

7.2. Měření koncentrace ciliatů na zařízení "BIOTESTER-2"

Kyvety připravené podle nároku 7.1 se postupně umístí do kyvetového modulu a odečtou se hodnoty. Zařízení BIOTESTER-2 má tři provozní režimy:

- měření a indikace výsledku každých 22 s;

- měření a indikace průměrné hodnoty výsledků 5 vzorků (každých 110 s);

- Měření a indikace průměrné hodnoty výsledků 10 vzorků (každých 220 s).

Práce se zařízením:

a) nastavte průměrovací režim "1" (LED nad tlačítkem svítí, sousední LED jsou vypnuté);

b) vložte kyvetu do kyvetového výklenku, zavřete víko, stiskněte tlačítko „START“;

c) displej zhasne, na 12 sekund (čas automatického ladění) se rozsvítí LED „COUNTING“ a po dalších 22 sekundách se na displeji zobrazí první hodnota koncentrace v libovolných jednotkách. Odpočítávání je doprovázeno světelným a zvukovým signálem trvajícím 2 sekundy;

d) během 22 s se uloží hodnota předchozího počtu, tentokrát stačí k zaznamenání výsledku.

Pokud je koncentrace toxických látek tak vysoká, že ciliati prakticky nepřijdou do vzorku (hodnoty zařízení v libovolných jednotkách jsou v rozsahu 000-008), pak bliká LED „ALARM“. To znamená, že zkušební vzorek musí být ředěn, dokud nejsou na přístroji získány významné hodnoty. (Nezapomeňte upravit skóre toxicity podle stupně ředění původního vzorku).

Pořadí operací při použití jiných režimů měření je stejné jako výše. Obvykle pracují v průměrovacím režimu po dobu 5 odečtů. Kontrolní a zkušební vzorky se vyrobí trojmo. Hodnoty opakování se zprůměrují a index toxicity se vypočítá v souladu s ustanovením 8.1.

8. Zpracování a prezentace výsledků

8.1 Hodnocení toxicity vzorku vody se provádí relativním rozdílem v počtu buněk v horních zónách kyvety s kontrolními a analyzovanými vzorky.

Index toxicity je definován jako:

kde jsou průměrné hodnoty zařízení pro kontrolu a analyzované vzorky.

Index toxicity () je bezrozměrná hodnota a může nabývat hodnot od 0 do 1 v souladu se stupněm toxicity analyzovaného vzorku.

Analyzované vzorky vody jsou podle hodnoty indexu toxicity klasifikovány podle stupně jejich znečištění do 4 skupin:

I. Přípustný stupeň znečištění ();

II. Mírný stupeň znečištění ();

III. Vysoký stupeň kontaminace (stejně jako významné hodnoty získané s 2, 4, 6-násobným zředěním analyzovaného vzorku);

IV. Extrémně vysoký stupeň kontaminace (významné hodnoty získané při 8násobném nebo více zředění analyzovaného vzorku).

8.2. Příklad záznamu výsledků měření

Ukázkové číslo	Znovu   tor-   nos   tričko	Indikace zařízení I cu					Prům. 5 měření   rhenium, cu	Prům. 3krát   tornos   tam 4 sr.u.	Index toxicity
Kontrolní prostředí   L-l
Ukázka 1					[email protected] Pokud nebyl platební postup na místě platebního systému dokončen, hotovost prostředky nebudou odečteny z vašeho účtu a neobdržíme potvrzení o platbě. V takovém případě můžete nákup dokumentu zopakovat pomocí tlačítka vpravo. Došlo k chybě. Platba nebyla dokončena z důvodu technické chyby, prostředků z vašeho účtu   nebyly odepsány. Zkuste počkat několik minut a zopakujte platbu znovu.

Odeslání vaší dobré práce do znalostní báze je snadné. Použijte následující formulář

Studenti, postgraduální studenti, mladí vědci, kteří ve svých studiích a práci využívají znalostní základnu, vám budou velmi vděční.

Publikováno dne http://www.allbest.ru/

Metody biologického zkoušení přírodních a odpadních vod

1. Základní principy biotestovacích metod a kritéria toxicity pro vodu

Biotesting (biologické testování) je hodnocení kvality environmentálních objektů (voda atd.) Na základě odpovědí živých organismů, které jsou testovacími objekty.

Jedná se o rozšířenou experimentální metodologickou techniku, což je toxikologický experiment. Podstata experimentu spočívá ve skutečnosti, že testovací objekty jsou umístěny do testovacího média a vydrží (projevují) určitý čas, během kterého je zaznamenána reakce testovaných objektů na účinek tohoto média.

Techniky biotestování se široce používají v různých oblastech environmentální činnosti a používají se pro různé účely. Biotestování je hlavní metodou při vývoji norem MPC pro chemikálie (biotestování toxicity jednotlivých chemikálií) a v konečném důsledku při posuzování nebezpečí pro životní prostředí a veřejné zdraví. Posouzení úrovně znečištění podle výsledků chemické analýzy, tj. interpretace výsledků z hlediska rizik pro životní prostředí se také silně opírá o údaje z biologických zkoušek.

Biologické testovací metody jsou v podstatě biologické, pokud jde o údaje získané metodám chemické analýzy vod: podobně jako chemické metody odrážejí vlastnosti účinku na vodní biocenózy.

Požadavky na postupy biotestování:

Citlivost testovaných organismů na dostatečně nízké koncentrace znečišťujících látek.

Nedostatek inverze reakce testovaných organismů na různé hodnoty koncentrace znečišťujících látek v rámci hodnot, které jsou zaznamenány v přírodních vodách;

Schopnost získat spolehlivé výsledky, metrologické zabezpečení metod;

Dostupnost zkušebních organismů pro sběr, snadnost kultivace a údržby v laboratoři;

Snadné provedení postupu a technických metod biotestu;

Nízké náklady na biotestování.

Vyvíjejí se dvě hlavní oblasti biotestování:

Výběr technik využívajících hydrobiony, pokrývající hlavní hierarchické struktury vodního ekosystému a vazby trofického řetězce;

Hledejte nejcitlivější testovací organismy, které by umožnily zachytit nízkou úroveň toxicity se zaručenou zárukou spolehlivosti informací.

Pro toxikologické hodnocení znečištění sladkovodních ekosystémů na základě biotestování vodního prostředí se doporučuje použít několik typů testovacích objektů: řasy, dafnie, ceriodafnie, bakterie, prvoky, vířníky, ryby.

Řasy jsou základem potravních řetězců ve všech přírodních ekosystémech. Nejcitlivější organismy na širokou škálu chemikálií od detergentů po NFPR. Buněčná smrt, zhoršená rychlost růstu, změna v procesech fotosyntézy a dalších metabolických. procesy. Chlorella vulgaris, Scenedesmus quadricauda, \u200b\u200bAnabaena, Microcystis, Oscillatoria, Phormidium.

Bakterie - změna rychlosti rozkladu (biodegradace) organických sloučenin / Nitrosomonas, Nitrosobacter; změna metabolických procesů v těle - Escherichia coli (hodnocení vlivu toxické látky na fermentaci glukózy)

Nejjednodušší. Daphnia. DDT, (HCH) hexachlorcyklohexan, HEAVY kovy (měď-zinek-kadmium-chrom), živiny. Daphnia magna.

Rotifery

Ryby. Guppies (Poecillia reticulata) - kovy, pesticidy; zebrafish (Brachidanio rerio).

Přírodní vodní ryby. Vysoce citlivé: - losos (pstruh), špice, pudink, plotice, char, okoun, top; středně citlivé: okoun, rudd, pražma, pstruh, kapr, bezútěšný.

Toxicita pro vodu

Přítomnost toxicity se posuzuje podle projevů negativních účinků na testované objekty, které se považují za ukazatele toxicity.

Mezi indikátory toxicity rozlišujte: obecné biologické, fyziologické, biochemické, chemické, biofyzikální atd.

Ukazatelem toxicity je zkušební reakce, jejíž změny jsou zaznamenány během toxikologického experimentu.

Je třeba poznamenat, že toxikologické (biotestové) ukazatele v environmentální a vodní toxikologii jsou chápány jako biotestové ukazatele pro různé testované objekty. Současně se v hygienicko-hygienické regulaci rozumí toxikologické ukazatele průměrné koncentrace toxických chemikálií (například při přidělování pitné vody charakterizují jeho neškodnost).

Při biotestování přírodních vzorků vody se obvykle objevují dvě otázky: - Je přírodní vzorek vody toxický? - jaký je stupeň toxicity, pokud existuje?

V důsledku biotestu vzorků na základě registrace indikátorů toxicity se toxicita hodnotí podle kritérií stanovených pro každý bioobjekt. Výsledky biotestování experimentálního vzorku ze zkoumané oblasti jsou porovnány s kontrolním, zjevně netoxickým vzorkem a přítomnost toxicity je posuzována na základě rozdílu v kontrole a zkušenosti.

V tomto případě se účinky expozice dělí na akutní a chronické. Jsou označovány jako akutní a chronické toxické účinky nebo jako akutní a chronická toxicita (OTD a CTD). Tyto termíny se používají k vyjádření výsledků biotestování.

Akutní toxický účinek - účinek, který způsobuje rychlou reakci zkoušeného objektu. Nejčastěji se měří testem na přežití po relativně krátkou dobu.

Chronický toxický účinek - účinek, který způsobuje odezvu testovaného objektu, projevující se po relativně dlouhou dobu. Měřeno pomocí testovacích reakcí: přežití, plodnost, změna růstu atd.

Reakce testovaných objektů na toxické účinky závisí na intenzitě nebo trvání expozice. Podle výsledků biotestování nalezněte kvantitativní vztah mezi velikostí dopadu a reakcí testovaných objektů.

Reakce organismů na účinky toxických chemických látek je komplexem vzájemně propojených evolučních formovaných reakcí, jejichž cílem je udržovat stálost vnitřního prostředí těla a v konečném důsledku přežití.

Byly odhaleny určité zákonitosti reakcí organismů na toxické účinky. Účinek toxické látky na organismus je obecně popsán dvěma hlavními parametry: koncentrací a dobou expozice (expozice). Právě tyto parametry určují stupeň vlivu toxické látky na organismus.

Expozice - období, během kterého je tělo pod vlivem zkoumaného faktoru, zejména chemické látky. Akutní nebo chronické toxické účinky se rozlišují v závislosti na expozici.

Toxický účinek se obvykle nazývá toxický účinek. K popisu vztahu mezi účinkem toxických látek na organismus a jeho koncentrací jsou navrženy různé funkce, například Haberova formule:

Kde E je účinek (výsledek) dopadu;

C je koncentrace účinné látky;

T - doba expozice (expozice).

E - představuje jakýkoli výsledek expozice (smrt testovaných objektů) a hodnoty C a T - lze vyjádřit v příslušných jednotkách.

Jak je vidět z Haberova vzorce, existuje přímý funkční vztah mezi účinkem doby expozice koncentraci: účinek bude větší, čím větší bude velikost účinku (koncentrace věcí) a / nebo jeho trvání.

Haberův vzorec vám umožňuje porovnat biologické účinky různých chemikálií analýzou jejich koncentrace nebo expozice. Rozdíly v kterékoli z těchto hodnot odrážejí rozdíly v citlivosti organismů na toxické účinky.

Při malých koncentracích nebo expozicích se účinek účinku projevuje v populaci malého počtu testovaných objektů, které se ukázaly jako nejcitlivější, tj. nejméně odolné vůči expozici. S rostoucí koncentrací nebo expozicí se snižuje počet rezistentních organismů a nakonec všem (nebo téměř všem) organismům se podaří registrovat jasně vyjádřené účinky toxických účinků. Během toxikologického experimentu se zjistí reakce testovaných objektů na velikost nebo dobu expozice.

Parametry chemické toxicity:

Letální koncentrace (LC50) - koncentrace toxické látky, která v určitém čase způsobí smrt 50% testovaných organismů (čím nižší je LC50, tím vyšší je toxicita chemické látky nebo vody)

Maximální neaktivní koncentrace - nejvyšší naměřená koncentrace chemické látky (zkušební voda), která nezpůsobuje pozorovaný chemický účinek (čím nižší je MNE, tím vyšší je toxicita chemické látky nebo odpadní vody).

Ne všechny organismy reagují stejně na stejný účinek. Reakce závisí na citlivosti na expozici.

Citlivost organismu na toxickou látku je soubor reakcí na jeho účinek, charakterizující stupeň a rychlost reakce organismu. Je charakterizována indikátory, jako je čas nástupu reakce (reakce) nebo konec toxické látky, ve které se reakce projevuje; výrazně se liší nejen u různých druhů, ale také u různých jedinců stejného druhu.

Podle řady citlivosti vyvinuté S.A. Patin (1988), testovací objekty lze uspořádat takto:

Ryby-zooplankton-zoobenthos-fytoplankton-bakterie-protozoa-makrofyty.

Existují i \u200b\u200bjiné řady citlivosti.

Například při biotestování vod buničinových a papírenských podniků: řasy-bakterie-ryby (ke snížení citlivosti).

Faktory ovlivňující biotest:

Faktory ovlivňující testované organismy (expozice; kultivační podmínky, v přírodě - životní podmínky rostlin a zvířat; věkové charakteristiky, roční období, potrava pro testované organismy, teplota (pesimum a optimální), vystavení světlu);

Faktory, které určují fyzikálně-chemické vlastnosti testované přírodní vody, na které závisí její toxicita pro testované organismy (čerstvost vzorku, přítomnost suspendovaných částic v něm).

2. Biotestovací metody pro různé skupiny organismů pro hodnocení kvality přírodních a odpadních vod

Zvažte základní metody pro stanovení akutních toxických účinků vody během krátkodobého biologického testu na korýše, řasy a ciliaty; metoda pro stanovení chronických toxických účinků vody na řasy.

Metody zpracování a vyhodnocení výsledků biotestování jsou založeny na standardních metodách statistického zpracování experimentálních dat, které jsou široce využívány v domácí i mezinárodní praxi.

Před provedením experimentů s biotestem musíte pěstovat kulturu testovaných organismů.

Biotest korýšů

Tato technika je určena ke stanovení akutní toxicity přírodních a odpadních vod vypouštěných do vodních útvarů.

1. Zásady pěstování korýšů Daphnia magna Straus a Ceriodaphnia affinis Lilljeborg

Doba zrání Daphnia magna před odstraněním mladistvých při optimální teplotě a dobré výživě trvá 5–10 dní. Délka života je 110 - 150 dní, při teplotách nad 25 ° C může být snížena na 25 dní.

Za optimálních podmínek následují parthenogenetické generace jednu za druhou každé 3-4 dny. U mladé dafnie je počet vajec ve spojce 10–15, pak se zvyšuje na 30–40 nebo více, klesá na 3–8 a na 0–2–3 dny před smrtí.

Kultura dafnie se pěstuje v luminostatu termostaticky regulovaném na 18-22 ° C (osvětlení 400-600 luxů, denní světlo 12-14 hodin). Je vhodné provádět experimenty na biologickém testování vody ve stejném luminostatu.

Za účelem získání výchozího materiálu pro biotestování se 30–40 samic s chovnými komorami plnými vajíček nebo embryí transplantuje do nádoby o objemu 0,5–2 l 1 den před biotestováním. Po objevení se mladistvých se od dospělých jedinců oddělují pomocí kapronových sít s různými průměry pórů.

Principy kultivace ceriodafnie jsou podobné principům popsaným pro dafnie. Je třeba si uvědomit, že ceriodaphnia je náročnější na obsah kyslíku ve vodě (nejméně 5 mg / l), optimální kultivační teplota je 23-27 ° С. Období zrání korýšů od narození do doby trosek mladistvých je kratší než období dafnie - od 4 do 5 dnů.

Při biotestování je důležité vzít v úvahu následující body:

Mladí korýši jsou 4-5krát citlivější na účinky toxických látek než dospělí.

Krmení korýšů během akutního experimentu snižuje toxicitu přibližně čtyřikrát.

V měkké vodě se zvyšuje toxicita látek. Ionty hořčíku obvykle snižují toxicitu solí, ionty vápníku - snižují toxicitu.

Přítomnost komplexujících látek (huminové kyseliny, aminokyseliny atd.) Zvyšuje hromadění toxických látek, ale snižuje jejich toxicitu.

Nedostatek kyslíku ve vodě urychluje hromadění toxických látek ve vodním prostředí.

Sluneční světlo zvyšuje toxicitu hlavně v důsledku zvýšení počtu volných radikálů.

Stanovení rezistence Daphnia Magna Straus na dichroman draselný

Nejprve je nutné posoudit vhodnost laboratorní kultury dafnie pro následné biotestování vod. Referenční toxickou látkou je dichroman draselný.

Sklenice s objemem 100 - 250 ml (21 kusů).

Pipety se měří na 1, 10, 25 ml 2. třídy přesnosti (na 1 kus). Baňka pro ředění (kontrolní) vody (RV) s objemem 3 litry. Odměrné baňky na 100 ml (1 ks), 250 ml (1 ks), 500 ml (2 ks), 1 000 ml (1 ks).

210 korýšů ve věku 4-24 hodin. Rozdíl ve věku jednotlivců by neměl přesáhnout 4 hodiny.

Připraví se 100 ml 0,1% roztoku K2Cr207 (1000 mg / l).

Za tímto účelem se 0,1 g sušeného K2Cr207 rozpustí ve 100 ml destilované vody.

Uspořádejte 21 sklenic s nápisy podle následujícího vzoru:

K1 0,25 mg / l 0,5 mg / l 0,75 mg / l 1 mg / L 2 mg / l 3 mg / l

K2 0,25 mg / l 0,5 mg / l 0,75 mg / l 1 mg / L 2 mg / l 3 mg / l

KZ 0,25 mg / l 0,5 mg / l 0,75 mg / l 1 mg / L 2 mg / l 3 mg / l

Přistání korýšů

Ve všech brýlích s roztoky zasaďte 10 korýšů ve stáří 4–24 hodin. Přistání se provádí pomocí mikropipet s odnímatelnými plastovými hroty. Konce špiček musí být nejprve nařezány na velikost dafnie jeden až dva dny.

Experiment

Počítání přežívajících korýšů po 24 hodinách vizuálně. Během experimentu nejsou krmeni žádní korýši. Úmrtnost korýšů u kontroly by neměla překročit 10%. Výsledky jsou zaznamenány v protokolu zkušeností.

3. Stanovení toxicity odpadních vod (přírodní) vody v Daphnia magna

Materiály

Brýle s kapacitou 150 - 250 ml (8–16 kusů).

Baňka pro ředění (kontrolní) vody s objemem 3 litry.

Odměrné baňky na 100 ml (1 ks), 1 l (1 ks).

Odměrný válec nebo odměrka na 150-200 ml.

Od 40 do 80 korýšů ve věku 4-24 hodin. Rozdíl ve věku jednotlivců by neměl přesáhnout 4 hodiny.

Tréninková zkušenost

Uspořádejte 16 sklenic s nápisy takto:

K1 St. voda b / r N 1 St. voda 1:10 N 5 St. voda 1: 100 N 9

K2 sv. Voda b / r N 2 sv. Voda 1:10 N 6 sv. Voda 1: 100 N 10

Zkrat St. Voda b / r N 3 St. voda 1: 10 N 7 St. voda 1: 100 N 11

K4 sv. Voda b / r N 4 sv. Voda 1: 10 N 8 sv. Voda 1: 100 N 12

Nalijte do sklenic kontrolní (ředicí vodu) a zkušební vodu (voda) 150 ml na sklenici:

K1-K4 - 600 ml ředicí vody (RV),

Voda sv./obj. (Bez ředění) - 600 ml (4 x 150 ml).

Voda sv. 1:10 - 100 ml Voda sv. B / r + 900 ml RV \u003d 1 l Sv. Voda 1: 10.

Voda sv. 1: 100 - 100 ml Voda sv. 1: 10 + 900 ml RV \u003d 1 l Sv. Voda 1: 100

Umístit sklenice s roztoky do luminostatu.

Pokud vzorky nesplňují výše uvedené standardy, je nutné upravit pH vzorků na 6,5 \u200b\u200b- 8,5 pomocí roztoků NaOH nebo HCl.

Nasycení testovaných vzorků kyslíkem by mělo také ležet v rámci stanovených limitů.

Přistání korýšů

Ve všech brýlích roste 5 korýšů ve stáří 4 až 24 hodin.

Experiment

Počítání mrtvých korýšů se provádí vizuálně po 1, 6, 24, 48, 72, 96 hodinách (konec stanovení akutní toxicity). Úmrtnost korýšů u kontroly by neměla překročit 10%.

Výsledky jsou zaznamenány v protokolu zkušeností.

Biotestování je ukončeno, pokud kdykoli v experimentu zemře 50% nebo více jedinců.

Pokud A\u003e \u003d 50%, pak je testovaná voda (experiment) akutně toxická.

Pokud A< 50%, то тестируемая вода не оказывает острого токсического действия.

Pro přesnější stanovení akutní toxicity je sestrojen graf, kde je čas v hodinách vynesen na osu x (osa X) a úmrtnost je zobrazena na ose y (osa Y) jako procento kontroly (A). Z grafu se zjistí LT50 - doba, během níž 50% Daphnia zemře.

Stanovení toxicity odpadních vod (přírodní) vody na Ceriodaphnia affinis

Materiály

Zkumavky s kapacitou 20 ml (20–40 kusů).

Baňka pro ředění (kontrolní) vody o obsahu 1 litr.

Od 40 do 80 korýšů ve věku 0,1–8 hodin. Rozdíl ve věku korýšů by neměl přesáhnout 4 hodiny.

Tréninková zkušenost

Uspořádejte trubky po 10 kusech v řadě podle následujícího schématu:

K1 Sv. Voda b / r N 1 Sv. Voda 1:10 N 1 Sv. Voda 1: 100 N 1

K2 sv. Voda b / r N 2 sv. Voda 1: 10 N 2 sv. Voda 1: 100 N 2

K3 St. voda b / r N3 St. voda 1: 10 N3 St. voda 1: 100 N 3

K4 Sv. Voda b / r N 4 Sv. Voda 1: 10 N 4 Sv. Voda 1: 100 N 4

K5 sv. Voda b / r N 5 sv. Voda 1: 10 N 5 sv. Voda 1: 100 N 5

K6 sv. Voda b / r N 6 sv. Voda 1: 10 N 6 sv. Voda 1: 100 N 6

K7 St. voda b / r N 7 St. voda 1: 10 N 7 St. voda 1: 100 N 7

K8 Sv. Voda b / r N 8 Sv. Voda 1:10 N 8 Sv. Voda 1: 100 N 8

K9 sv. Voda b / r N 9 sv. Voda 1: 10 N 9 sv. Voda 1: 100 N 9

K10 St. voda b / r N 10 St. voda 1:10 N 10 St. voda 1: 100 N 10

Do zkumavek o objemu 15 ml nalijte zkumavky (ředicí voda) a odpadní vodu (St.water)

K1-K10 - 150 ml ředicí vody (RV).

Odpadní voda b / r (bez ředění) - 150 ml (10 x 15 ml).

Odpadní voda 1:10 - 25 ml St. voda b / r + 225 ml PB \u003d 250 ml St. voda 1:10.

Odpadní voda 1: 100 - 25 ml St. voda 1: 10 + 225 ml PB \u003d 250 ml St. voda 1: 100.

Vložte zkumavky s roztoky do luminostatu.

Změřte teplotu v luminostatu (norma 23-27 ° С), pH roztoků (norma 6,5 \u200b\u200b- 8,5), koncentraci rozpuštěného kyslíku (norma před zahájením experimentu 6 mg / l, na konci experimentu - ne méně než 4 mg / l )

Pokud vzorky nesplňují výše uvedené standardy, je nutné upravit pH vzorků na 6,5 \u200b\u200b- 8,5 pomocí roztoků NaOH nebo HCl. Nasycení testovaných vzorků kyslíkem by mělo také ležet v rámci stanovených limitů.

Režim osvětlení v luminostatu je 12 hodin při intenzitě 400-600 luxů.

Přistání korýšů

Ve všech zkumavkách pěstujte korýš 1 ve věku 0,1–8 hodin. Rozdíl ve věku korýšů by neměl přesáhnout 4 hodiny.

Experiment

Počítání mrtvých korýšů se provádí vizuálně po 1, 6, 24, 48 hodinách (konec stanovení akutní toxicity). Během experimentu nejsou krmeni žádní korýši. Výsledky jsou zaznamenány v protokolu zkušeností.

Zpracování výsledků je podobné těm předchozím.

4. Biotest řas

Scenedesmus quadricauda

Tato technika je určena ke stanovení toxicity přírodních a odpadních vod.

Obecné zásady kultivace mikrořas

Efektivní kultivace jednobuněčných zelených řas v laboratoři je dána především přítomností minerálních prvků v živném médiu, poměrně intenzivním osvětlením (2000-3000 luxů) a určitou teplotou (18-20 ° C).

Nejlepší prostředí pro pěstování zelených řas pro toxikologii je živné médium Uspensky N 1, které obsahuje nižší celkovou koncentraci soli.

Všechny manipulace s médiem Ouspensky N 1 při práci s řasami Scenedesmus se provádějí za přísných podmínek sterility.

Nepřijatelné je společné pěstování této řasy s chlorellou v jednom luminostatu (chlorella rychle ucpává a potlačuje stendesmusovou kulturu).

Trvání experimentů k detekci toxicity vody mohou být 4, 7, 14 nebo více dní, v závislosti na úkolech. Maximální akumulace toxického činidla v buňkách řas je obvykle pozorována na konci 3 až 4 dnů, proto je nejčastěji stanovení akutní toxicity omezeno na 4 dny.

Pokud byla v důsledku biotestování na akutní toxicitu odhalena spolehlivá stimulace růstu řas, je pro konečné posouzení toxicity vzorku nutné provést chronický experiment (až 14 dní).

Spolehlivá stimulace růstu řas indikuje přítomnost eutrofického znečištění a spolehlivá inhibice růstu řas indikuje přítomnost toxického znečištění.

Kulturní příprava

V experimentu použijte 5-10 denní kultivaci, která je v exponenciální růstové fázi.

Před setím se kultura koncentruje jedním ze tří způsobů: usazením po dobu 2-3 dnů, odstředěním, filtrací přes membránový filtr č. 4 nebo filtračním papírem s modrou stuhou. Výsledná buněčná suspenze (koncentrát) se použije pro následné pokovování.

Vyrábí se ve velké experimentální baňce o objemu 1,5 l, v případě biotestování v bankách (každá po 100 ml) nebo v baňce o kapacitě 150 ml během biotestování v penicilinových váčcích (každá po 10 ml). Obvykle se vyžaduje přibližně 30 μl suspenze ve 30 ml vody.

Po naočkování by v experimentálních bankách mělo být asi 200 až 300 tisíc buněk řas na 1 ml (ne více než 500 tisíc / ml) - sotva znatelná nazelenalá skvrna na bílém pozadí.

Z velké baňky vylijte kulturu do baněk (3 repliky po 100 ml) nebo do lahviček penicilinu (3 repliky po 10 ml).

5. Vyhodnocení výsledků experimentu za účelem stanovení odolnosti kultury vůči dichromanu draselnému

Počítání se provádí pomocí mikroskopu (například typu "Biolam") při 80 až 100násobném zvětšení.

Pro výpočet počtu buněk pomocí počítací komory Goryaev nebo Fuchs-Rosenthal. Fotoaparát a jeho krycí sklo se odmastí, kamera se zakryje krycím sklíčkem a třením, dokud se nevytvoří interferenční kroužky duhy. Z každé baňky se pipetou nanese jedna kapka pečlivě promíchané suspenze na horní a spodní okraj krycího sklíčka. Komora je naplněna tak, aby se nevytvářely vzduchové bubliny, přebytečná suspenze je vytlačována skrz drážky. Prohlédněte si 16 čtverců diagonálně nebo celé pole komory v případě malého počtu řas (alespoň jedna buňka počítá alespoň 50 buněk).

Z každé baňky se prozkoumají nejméně tři vzorky.

Posouzení toxického účinku chemické sloučeniny nebo zkušební vody se provádí na základě významu rozdílů mezi počtem buněk řas u kontroly a v experimentu.

V tomto případě vypočítejte:

a) aritmetické průměrné hodnoty počtu buněk - Xi a X (od dvou, respektive šesti).

b) počet buněk jako procento kontroly. Částka (X - Xi)

c) směrodatná odchylka (b):

kde n je počet opakování; v tomto případě (viz tabulka 3.1) n \u003d 3;

c) aritmetická průměrná chyba (X): S \u003d b / kořen n;

d) Td - kritérium spolehlivosti pro rozdíly mezi dvěma srovnávanými veličinami:

kde Xk a Xo jsou srovnávané průměrné hodnoty (v kontrole a experimentu),

Sk - Takže - čtverce průměrných chyb v ovládání a zkušenosti.

Td se počítá pro každý den a porovnává se s tabulkovou hodnotou Tst - standardní hodnotou kritéria studenta.

Berou hladinu významnosti P \u003d 0,05 a stupeň volnosti (n1 + n2 - 2), tj. (3 + 3 - 2) \u003d 4.

Tst se stupněm volnosti 4 je 2,78.

Pokud je Td větší nebo rovno Tst, pak je rozdíl mezi kontrolou a experimentem významný - testovaná voda je znečištěná (toxické nebo eutrofické znečištění)

Pokud je Td menší než Tst, pak rozdíl mezi kontrolou a experimentem není významný - testovaná voda není kontaminována.

K výpočtu Td můžete použít kalkulačky, jako jsou MK-51 a MK-71, stejně jako počítačové tabulky (například program Sigma CSIAK), což výrazně urychluje práci.

Pro grafické znázornění výsledků biotestování na ose x je čas vynesen do grafu ve dnech a na ose y buď počet buněk řas v 1 ml nebo počet buněk řas jako procento kontroly.

6. Stanovení odolnosti Scenedesmus quadricauda na dichroman draselný

Přidá se 30 μl KN03, 30 μl MgS04, 30 μl Ca (NO 3) 2, 30 μl KH2P04, 30 μl K2C03 postupně ve 30 ml destilované vody (kontrola).

Chronická zkušenost (ve vesikulách)

Sedmý den biotestování se kontrolní a testovací voda mění za sterilních podmínek. Současně se do nové dávky bublin nalije 7,5 ml kontrolní a zkušební vody. Potom bylo do vesikul přidáno 0,01 ml (10 μl) každé z 5 matečných louhů solí a 2,5 ml staré kultury z vezikul, ve kterých byl proveden biotest v akutním experimentu. Počítání počtu buněk se provádí 7., 10. a 14. den.

V praxi je vhodné použít tabulku pro vyhodnocení výsledků biotestování na 5-bodové stupnici (tabulka 3.3).

Je třeba si uvědomit, že nárůst biomasy řas může být spojen s přítomností eutrofních kontaminantů ve zkušební vodě, v tomto případě lze přítomnost toxického účinku posoudit po testování na několika zkoušených objektech.

7. Biotestování na ciliatech

Metoda je založena na jedné z možností stanovení akutní toxicity vody přežitím ciliates Paramecium caudatum.

Používá:

Stanovit toxicitu odpadních vod vstupujících do biologických čistíren, což umožňuje technologické přizpůsobení čištění a čištění odpadních vod;

Abychom určili toxicitu místních toků odpadních vod, což nám umožňuje určit jejich vzájemné působení, abychom určili příspěvek každého toku k toxicitě odpadních vod jednotlivého podniku, celkovou toxicitu odpadních vod vstupujících do biologických čistíren;

Stanovit toxicitu vodných roztoků jednotlivých látek a jejich směsí.

Princip techniky

Metodika pro stanovení akutní letální toxicity odpadních vod podle míry přežití ciliatů je založena na stanovení počtu mrtvých nebo imobilizovaných jedinců po vystavení zkoušené vodě. Kritériem akutní letální toxicity je smrt nebo imobilizace 50% nebo více jedinců do 1 hodiny ve zkušební vodě ve srovnání s jejich počátečním množstvím.

Testujte organismus

Jako zkušební objekt se používá laboratorní monokultura Paramecium caudatum Ehrenberg.

Paramecium caudatum - jednobuněčné organismy o velikosti 180-300 mikronů. Tělo je ve tvaru doutníku nebo vřetena, pokryté hustou skořápkou (granule).

Paramecium caudatum je masivní druh ve sladké vodě s vysokým obsahem organických látek. V odpadních vodách je často hlavní druh, poly-alfa-mesosaprob. Nejjednodušší, včetně ciliárních infusorií, tvoří hlavní část aktivní fauny microfauna. Účastní se uvolňování vyčištěné vody ze suspendovaných bakteriálních buněk a ze sypkých, špatně uložených bakteriálních aglomerátů, čímž přispívají ke zvýšení účinnosti čištění.

Izolace a kultivace

Vylučování z aktivovaného kalu. Nejmobilnější a největší jednotlivec je zachycen ze vzorku aktivovaného kalu ze zpracovatelských zařízení a převeden do mikro akvária se sterilní vodovodní vodou.

Postupným přenosem tohoto jedince z studny do studny se dosáhne toho, že je oddělen od ostatních prvoků a cyst. Poté se promyté ciliatky umístí do zkumavky s kultivačním médiem.

Po 7-8 dnech od takto získané monokultury je jeden z největších a nej mobilnějších jedinců znovu přenesen do čerstvého média.

Po 8 až 10 dnech lze kulturu použít ke stanovení toxicity.

Pěstování ciliatů v mléce. Kultura paramecium se pěstuje v dechlorované vodovodní vodě, do které se přidá pasterizované mléko zředěné 20krát stejnou vodou. Resuscitovaná kultura se podává infuzí jednou za měsíc (v případě potřeby jednou za tři týdny).

Materiály a zařízení

Počítání Paramecium caudatum se provádí pomocí binokulárního mikroskopu MBS-9, MBS-10 nebo jiného, \u200b\u200bcož poskytuje 8-24násobné zvýšení. Konstrukce mikro akvárií vyrobených z průhledného organického skla je znázorněna na obr. 1. K ředění a nanášení stejného množství zkoušeného vzorku se používají standardní skleněné pipety.

Biotestování vzorků vody se provádí nejpozději 6 hodin po jejich výběru, pokud není možné provést analýzu v uvedeném čase, vzorky vody se ochladí (+ 4 ° C).

Konzervace vzorků pomocí chemických konzervačních látek není povolena.

Jako kontrola se používá voda z vodovodu, která je dechlorována sedimentací a provzdušňováním pomocí mikrokompresoru po dobu 7 dnů.

Pro stanovení toxicity jednotlivých látek nebo jejich směsí se z nich připravují roztoky přidáním určitého množství matečného louhu, zkoušené látky (látek) (c) do kohoutku dechlorované vody. Zásobní roztoky se připravují v destilované vodě.

Během biotestování by teplota zkoušeného vzorku měla odpovídat teplotě kultury.

Pokud jsou ve vzorku přítomny hrubé suspenze, je nutná filtrace.

Během biotestování by pH zkoušených roztoků mělo být v rozmezí 6,5 až 7,6.

Biotestování se provádí v místnosti, která neobsahuje škodlivé páry a plyny, s okolním světlem a teplotou vzduchu 18-28 ° C.

Biotestování

Pro biotestování nezředěné odpadní vody nebo jejích ředění, jakož i roztoků jednotlivých toxických látek (směs látek) se používá mikrok akvárium s otvory, které se umístí na stolek stereomikroskopu.

Jeden z otvorů je naplněn kulturou ciliatů pomocí kapilární pipety.

10 až 12 zvířat na jamku se umístí do volných jamek kapilární pipetou, takže alespoň 30 ciliatů ve třech jamkách spadne do jednoho vzorku testované vody (trojnásobně).

Při výsadbě zkoušeného objektu by množství kultivační tekutiny v jamce nemělo překročit 0,02 ml.

Jako kontrola se používají tři jamky.

Po výsadbě se ciliati vlijí do kontrolních jamek s 0,3 ml dechlorované vodovodní vody a do experimentálních jamek s 0,3 ml vzorku testované vody. Je zaznamenán čas zahájení biotestování a počet jedinců v každé jamce je počítán pod mikroskopem.

Do akvária s Petriho miskou se umístí mikro akvárium s naplněnými jamkami, na jehož dno se umístí filtrační papír navlhčený vodou tak, aby se obsah jamek neodpařil, a inkubuje se po dobu 1 hodiny při teplotě 22 až 24 ° C. Po uplynutí této doby se přeživší počítají pod mikroskopem. Pozůstalí jsou považováni za ciliates, kteří se volně pohybují ve vodním sloupci. Imobilizovaní jedinci jsou považováni za mrtvé. Výsledky počítání jsou zaznamenány v sešitu.

Výsledky biotestování se považují za správné a zohlední se, pokud smrt ciliatů v kontrolních jamkách nepřesáhla 10%.

Po spočítání jednotlivců se v každé ze tří jamek nachází aritmetický průměrný počet ciliatů přežívajících ve zkušební vodě.

Zkoušená voda se vyhodnotí jako mající akutní letální účinek, pokud v ní do 1 hodiny zemře 50% nebo více ciliatů.

Při stanovení akutní letální toxicity ředění vzorku odpadní vody nebo vodného roztoku jednotlivé látky (směsi) se stanoví průměrný letální ředicí poměr (průměrná letální koncentrace), který způsobí smrt 50% testovaných objektů během 1 hodiny - LCR 50 - 1 h (LC 50 - 1 h).

Pro vytvoření grafu pro výpočet LCR 50 - 1 h (LK 50 - 1 h) je testovací parametr vyjádřen v libovolných jednotkách - probit a ředicí poměr (koncentrace) - v logaritmických veličinách.

Na ose x jsou vyneseny logaritmy koncentrací multiplicity ředění odpadních vod (koncentrace látek), na ose y jsou hodnoty parametru testu v přestávkách Výsledné body spojují čáru.

Od bodu na souřadné ose odpovídající 50% smrti testovaného objektu nakreslete čáru rovnoběžnou s osou vodorovné osy, dokud se neprotne s čarou grafu.

Z bodu jejich průniku spusťte kolmý k ose vodorovná a vyhledejte logaritmy LCR 50 - 1 h.

Hodnota nalezeného logaritmu se převede na hodnotu ředicího faktoru (koncentrace vyjádřená v mg / l látky).

Výsledky biotestování jsou uvedeny ve formě protokolu.

Po biotestování se mikrok akvária promyjí vodou (teplota ne vyšší než 40 ° C), otírají se vatou namočenou v alkoholu a promyjí se destilovanou vodou.

Posouzení toxicity vody pomocí biotestu na řasách.

Pomocí vzorce vypočítáme rychlost růstu řas za 96 hodin (4 dny).

M \u003d 103,

kde M je počet buněk řas, tisíc buněk / ml;

m je počet počítaných buněk;

n je počet vypočítaných malých čtverců kamery;

V je objem části komory odpovídající ploše malého čtverce, ml.

8. Posouzení toxicity vody pomocí rychlého biotestu na rotátorech

Pro stanovení možných akutních toxických účinků zkušební vody provádíme expresní biotestování na hromadné kultuře rotiferů.

Pro posouzení toxického účinku testované vody používáme průměrná data SOS (ukazatel rychlosti vyčištění média). SOS pro experiment spočítáme podle vzorce (2).

biotest vodní toxicita draslík

SOS \u003d [(Co - Ct) / (CoNt)] V,

kde SOS - ukazatel rychlosti vyčeření média, µl / (ind. min.);

CO a Ct jsou počet buněk řas na jednom velkém čtverci Goryaevovy komory na začátku a na konci biotestování;

N je počet rotátorů v mikro akváriu;

t je doba biotestu, min;

V je objem vody v mikro akváriu, µl.

Literatura

1. Bakaeva E.N., Nikanorov A.M. Vodní organismy při posuzování toxicity pozemních vod. M.: Nauka, 2006,257 s.

2. Bakaeva E.N. Stanovení toxicity vodního prostředí. Metodická doporučení. Rostov na Donu: Everest 1999,48 s.

4. Nikanorov A.M., Khoruzhaya T.A., Brazhnikova L.V., Zhulidov A.V. Monitorování kvality vody: hodnocení toxicity. - Petrohrad: Gidrometeoizdat, 2000, str. 10-15, 39-42.

5. Bakaeva E.N. Ekologické a biologické základy rotorů v kultuře. Rostov na Donu: SKNTs VSh, 1999.51 s.

6. Bakaeva E.N. Schopnost zajistit kvalitu informací pomocí biotestovacích metod na rotorech // Vědecké myšlení na Kavkaze. 1999 No. 5. S. 26-36

7. Bakaeva E.N., Makarov E.V. Ekologické a biologické základy rotiferů normálních a pod antropogenním stresem. Rostov na Donu: SKNTs VSh, 1999.206 s. 2.

9. Nikanorov A.M., Khoruzhaya T.A., Brazhnikova L.V., Zhulidov A.V. Monitorování kvality vody: hodnocení toxicity. - Petrohrad: Gidrometeoizdat, 2000, S. 16-39.

Publikováno na Allbest.ru

...

Podobné dokumenty

Metody bioindikace pro řasy a biotestování podle Lepidium sativum L. Druhové složení řas a sinic v odpadních vodách Městského vojenského podniku "Ufavodokanal". Studium kvantitativního vývoje řas a sinic v kontaminované a čištěné vodě.

práce, přidáno 09.06.2014


Klasifikace a metody čištění odpadních vod. Kvalitativní a kvantitativní účtování řas a sinic. Metodika stanovení toxicity vody pomocí indikátorů řeřichy (Lepidium sativum L.). Biotestování odpadních vod MUP "Ufavodokanal".

práce, přidáno 06.06.2014


Složení odpadních vod potravinářského průmyslu. Posouzení dopadu odpadních vod potravinářského průmyslu na stav přírodních vod, na volně žijící živočichy vodních útvarů. Právní rámec a metody pro zajištění environmentální legislativy v oblasti ochrany přírodních vod.

práce, přidáno 10.08.2010


Vliv vody a látek v ní rozpuštěných na lidské tělo. Hygienické toxikologické a organoleptické ukazatele škodlivosti pitné vody. Moderní technologie a metody čištění přírodních a odpadních vod, hodnocení jejich praktické účinnosti.

seminární práce přidána 01/03/2013


Vlastnosti používání biotestů a bioindikačních metod pro monitorování životního prostředí. Kontrola kvality přírodních a odpadních vod pomocí bioindikátoru Daphnia magna Strauss. Citlivost indikátoru na různé chemikálie.

práce, přidáno 10/06/2009


Účel a základní metody biologického čištění vody. Význam kvalitního čištění odpadních vod pro ochranu přírodních nádrží. Degradace organických látek mikroorganismy za aerobních a anaerobních podmínek, hodnocení výhod této metody.

abstrakt, přidáno 14/14/2010


Opětovné použití odpadních vod jako hygienický problém. Biologické a chemické znečištění odpadních vod. Metody čištění odpadních vod a bezpečnostní problémy s využitím obnovené vody. Posouzení vlivu použití sedimentu na životní prostředí.

seminární práce, přidáno 12/27/2009


Problém nakládání s odpady výroby a spotřeby. Výzkumné metody biotestování. Posouzení testovacích objektů. Realizovatelnost stanovení třídy nebezpečnosti odpadu pomocí biotestu pro ZAO Trolza z ekonomického hlediska.

prezentace přidána 21. 6. 2012


Zdroje znečištění vnitrozemských vod. Metody čištění odpadních vod. Volba technologického schématu čištění odpadních vod. Fyzikálně-chemické metody čištění odpadních vod pomocí koagulantů. Separace suspendovaných částic od vody.

abstrakt, přidáno 5. prosince 2003


Čištění a bělení přírodní vody koagulanty a flokulanty. Podmínky pro použití flokulantů pro úpravu vody. Metody pro stanovení ukazatelů kvality pitné vody. Výzkum flokulačních vlastností nových akrylamidových kopolymerů ve vodě.

Text práce je zveřejněn bez obrázků a vzorců.
   Plná verze práce je k dispozici na kartě „Soubory práce“ ve formátu PDF

"Potvrzuji, že všechno, co se narodilo ze Země, žije mimo zemskou vlhkost,

a v jakém stavu je tato vlhkost

podmínkou je také rostlina "

Hippokrates

Řízení

Tato slova, kterými hovořili Hippokrati ve starověku, neztratila nyní význam. V naší době si společnost uvědomila nebezpečí toxického znečištění povrchových vod a do monitorovací praxe dospěla k nutnosti zavést zcela nové nekonvenční přístupy, zejména biologické testování. Biotesting je studie účinku různých látek na živé organismy. Široce rozšířené používání biotestovacích metod v praxi hodnocení kvality vody je naléhavou potřebou času, protože ani nejpokročilejší analytická chemie neposkytne úplné informace o toxicitě pro životní prostředí. Analýza stávajících metod pro hodnocení kvality přírodních vod navíc ukázala, že biotestování je nejpřesnějším, nejrychlejším a nejlevnějším způsobem ochrany přírodních vod.

V našem výzkumu používajícím tuto metodu jsme se rozhodli zjistit, v jakém stavu je voda našeho města, ve které pijeme a ve které vodě rostliny, které používáme jako potrava.

Hypotéza:k posouzení stupně kontaminace lze použít metody biologických zkoušek

přírodní vody.

Předmět studia:  stupeň znečištění přírodních vod Pyatigorsku.

Předmět výzkumu:  jednoleté rostliny čeledi Gramíneae: oves, ječmen, pšenice, jednoleté rostliny čeledi zelí, nebo kruciferovití (Brassicaceae) - řeřicha a ředkvičky.

Účel této práce - posoudit znečištění přírodních vod Pyatigorsku podle sazenic různých indikátorových rostlin.

Úkoly:

analyzovat teoretické přístupy ke studiu tohoto tématu;

osvojit si metodiku biotestování;

stanovit sezónní dynamiku toxicity přírodních vod v Pyatigorsku;

k určení závislosti vývoje testovaných rostlin na toxicitě přírodních vod.

1. Přehled literatury.

1. Biotestovací metody.

Jedním z hlavních důvodů negativních důsledků antropogenního znečištění přírodního prostředí je toxicita znečišťujících látek pro biotu. Právě přítomnost toxických látek v životním prostředí vede ke smrti všech živých věcí, ke ztrátě čistých zón komunit organismů ak jejich nahrazení eurybiontickými druhy. Pro stanovení toxicity pro životní prostředí existují různé fyzikální a chemické metody, ale v poslední době se široce využívají i biologické metody pro hodnocení stavu živých organismů (dodatek 1).

Konec konců, když mluvíme o znečištění vody, půdy, atmosféry, jejich toxicity, máme na mysli, jak jsou příznivé pro živé organismy v nich, pro lidské zdraví. Mezi nejradikálnější metody patří toxikologické metody biologických zkoušek. Biotestem se rozumí test za přesně definovaných podmínek působení látky nebo komplexu látek na vodní organismy zaznamenáním změn biologického indikátoru sledovaného objektu ve srovnání s kontrolou. Studované organismy se nazývají testovací objekty a zkušenost je biotestování (Lysenko, 1996). Tato levná a univerzální metoda byla v posledních letech široce používána po celém světě k hodnocení kvality environmentálních objektů. V roce 1996 byl v Rusku zahájen experiment na zavedení metod biotestování odpadních vod vypouštěných do přírodních vodních útvarů a dodávaných do zařízení biologického čištění. Pomocí biotestování můžete získat údaje o toxicitě konkrétního vzorku kontaminovaného chemikáliemi antropogenního nebo přírodního původu. Tato metoda umožňuje skutečné posouzení toxicity vlastností média v důsledku přítomnosti komplexu znečišťujících látek a jejich metabolitů. Živé organismy vždy reagují na změnu životního prostředí v jednom nebo druhém stupni, ale v některých případech to nelze detekovat fyzikálními nebo chemickými metodami, protože rozlišovací schopnosti zařízení nebo chemických analýz jsou omezené. Citlivé organismy, indikátory reagují nejen na malé dávky faktoru prostředí, ale také adekvátně reagují na vliv komplexu faktorů (Gruzdeva, 2002). .

Biotesting vám umožní identifikovat oblasti a zdroje znečištění. Jako testovací objekty se používají bakterie, řasy, vyšší rostliny, pijavice, dafnie, měkkýši, ryby a další organismy. Pro zvýšení tolerance vůči znečištění jsou organismy uspořádány v následující řadě: houby, lišejníky, jehličnany, bylinné rostliny, listnaté rostliny. Každá z nich má výhody, ale žádná není univerzální, nejcitlivější na všechny látky. K zajištění detekce přítomnosti toxického činidla s neznámým chemickým složením v přírodních vodách by se měla použít sada testovacích předmětů představujících různé skupiny organismů. Při výběru testovacích organismů vycházejí ze specifické toxicity možných znečišťujících látek, charakteristik nádrže a požadavků spotřebitelů vody. U testovaných organismů lze rozlišit soukromé testovací funkce. Integrální parametry charakterizují stav systému nejobecnějším způsobem. U organismů zahrnují základní charakteristiky přežití, růst a plodnost. Například pro tělo mohou být fyziologické, biochemické a histologické parametry soukromé.

1. Biologické testování přírodních vod.

Biologické testování přírodních vod je ve výzkumných projektech široce používáno od začátku 80. let (dodatek 2). Důvodem je výrazné zvýšení úrovně znečištění vodních útvarů a naděje odborníků, že biotest může alespoň částečně nahradit chemickou analýzu vody, protože asi 55 km 3 odpadních vod je vypouštěno do vodních útvarů ročně, z nichž je 20 km 3 znečištěno. (Stepanovskikh, 2001). Pouze asi 10% vod vyžadujících úpravu je vyčištěno na standardní kvalitu (Yablokov, 2005).

V roce 1991 biotesting byl zaveden jako povinný prvek kontroly kvality povrchových vod, který je stanoven „Pravidly ochrany povrchových vod“ (1991). Ukazatele biologické biologické zkoušky na přírodní vodě jsou zahrnuty do seznamu indikátorů pro identifikaci ekologických havarijních zón a zón ekologické katastrofy (Tumanov, Postnov, 1983). Biotestovací metody jsou charakteristické pro stupeň dopadu na vodní biocenózy. Takže A.M. Grodzinsky D.M. Grodzinsky (1973) popisuje řadu biologických vzorků pro testování toxicity přírodních vod. Podle přijaté definice je biotestování vody hodnocením kvality vody pomocí reakcí organismů, které jsou testovacími objekty. Test klíčení semen se používá ke stanovení účinků různých fyziologicky aktivních látek. Jako indikátory toxicity se používají semena zemědělských rostlin. Mezi plodinami jsou nejcitlivější salát, vojtěška, cereálie a kříže, mezi necitlivé druhy patří kukuřice, hrozny, rosaceae a jitrocel (Ramad, 1981). Biotestovací metody musí splňovat následující požadavky: relativní rychlost chování, získání dostatečně přesných a reprodukovatelných výsledků, dostupnost vhodného pro označování objektů ve velkém počtu. V současné době jsou dobře známy biotestovací metody, které jsou zaměřeny na stanovení toxicity vodního prostředí v důsledku přítomnosti určitých skupin chemických sloučenin, zejména organofosforu. Nejzkoušené na přírodních vodách je enzymatická metoda V.I. Kozlovskaya.

1. Výhody biotestů.

Hlavními výhodami biotestování jsou jednoduchost a přístupnost metod formulace, vysoká citlivost testovaných organismů na minimální koncentrace toxických látek, rychlost a absence potřeby nákladných činidel a vybavení. Podle některých autorů nemůže žádný z jednotlivých organismů sloužit jako univerzální testovací objekt pro látky různé chemické povahy, a proto by k zajištění detekce toxického činidla v životním prostředí měla být použita sada biotestů (Braginsky et al. 1979; Lesnikov, 1983; Filenko, 1989 )

Biotestovací metody detekují toxicitu, která je integrálním ukazatelem znečištění životního prostředí. Stejně jako všechny integrální ukazatele mají tu nevýhodu, že neodhalují jednotlivé znečišťující látky přítomné ve vzorku. Bylo publikováno mnoho prací o biotestování vodního prostředí, ale byly provedeny hlavně s cílem posoudit toxicitu nově syntetizovaných chemikálií, léčivých přípravků nakoupených importem a také při vývoji předpisů pro chemické sloučeniny. Existuje mnohem méně publikací o biotestování odpadních vod a ještě méně o biotestování přírodních vod (Nikanorov, Khoruzhaya, 2001).

Bioindikační metody, které nám umožňují studovat vliv technogenních znečišťujících látek na rostlinné a živočišné organismy na neživou přírodu, jsou nejpřístupnější. Bioindikace je založena na úzkém vztahu živých organismů s podmínkami prostředí, ve kterém žijí. Změny v těchto podmínkách, například zvýšení slanosti nebo pH vody, mohou vést k vymizení některých typů organismů, které jsou na tyto ukazatele nejcitlivější, a vzhledu jiných, pro které bude takové prostředí optimální.

Existují různé biologické ukazatele. Přítomnost určitých znečišťujících látek může být posuzována podle vnějších znaků rostlin a zvířat. Díky „paměti“ těchto organismů se lze také dozvědět o roli těch faktorů, které v současné době již nefungují. Například výskyt černých skvrn na listech lípy nám říká, že v zimě byly stěrače příliš nadšené posypáním sněhu solí, aby se urychlilo jeho tání, a skvrny na listech velkého jitroce říkají o emisích oxidu siřičitého. Na základě šířky prstenů borovice v blízkosti chemické továrny je možné určit, ve kterých letech rostlina zvláště znečišťovala. Během let silného znečištění ovzduší jsou položeny tenčí prsteny. Podle výšky některých rostlin lze posoudit koncentraci solí ve vodě. Například třtina může dosáhnout výšky 4 m, ale pokud je obsah soli ve vodě vysoký, tato rostlina nebude růst o více než 0,5 m. Některé mechy a lišejníky jsou ukazateli znečištění ovzduší. Například analýza lišejníků ve Švédsku odhalila výskyt radioaktivního prachu z jaderné elektrárny v Černobylu. Existují speciální živé nástroje - briometry - malé krabičky s mechy určitých typů, které určují způsob kouře v atmosféře.

Praktická část.

Výzkum provedený dne technikynavrhuje A.I. Fedorova a A.N. Nikolskaya v "Workshopu o ekologii a ochraně životního prostředí", 2003, jakož i v učebnici pro univerzity "Monitoring životního prostředí" vydané T.Ya. Ashikhmina, 2005.

V průběhu roku 2015 byly provedeny studie o metodě biotestování toxicity přírodních vod sazenicemi indikátorových rostlin.

Všechny studie na toto téma byly provedeny v laboratoři chemie a biologie na střední škole MBOU střední školy č. 5 v Pyatigorsku ve dne, s kombinací umělého a přirozeného osvětlení ve standardních podmínkách optimálních pro testovací rostliny. Úroveň znečištění vody můžete vyhodnotit pomocí testu klíčení semen. Takové testování se provádí jako předběžné pro identifikaci zvláště kontaminovaných vodních útvarů za účelem následné chemické analýzy. Jako testovací rostliny byly použity sazenice vyšších rostlin: pšenice, ječmen, oves, řeřicha řeřichová. Navrhovaná metoda biologického hodnocení toxicity přírodních vod sazenic indikátorových rostlin byla provedena ve dvou verzích:

1. Zalévání sazenic zkušebních rostlin zkušební vodou.

2. Hromadění zkoušeného roztoku mezi kotyledony dvouděložných rostlin.

V prvním provedení byla jako zkušební rostliny použita semena pšenice, ovsa a ječmene. Ve druhé variantě byly použity pouze sazenice dvouděložných rostlin: řeřicha řeřichová, ředkev.

Ze všech rostlin používaných ve výzkumu má řeřicha vysokou citlivost na znečištění vody těžkými kovy. Tento bioindikátor je charakterizován rychlým klíčením semen a téměř 100% klíčivostí, které je znatelně sníženo v přítomnosti znečišťujících látek. Kromě toho výhonky a kořeny řeřichy pod vlivem znečišťujících látek podléhají znatelným morfologickým změnám (zpomalení růstu a zakřivení výhonků, snížení délky a hmotnosti kořenů) (Golubkina, 2008). . Za účelem prevence byla semena před klíčením nakládána. Suchá semena byla ponořena do 1% roztoku manganistanu draselného po dobu 0,5 hodiny a poté byla promyta destilovanou vodou za použití dvou vrstev gázy, sušena na filtračním papíru na vzduchu.

(1 možnost).

2-3 dny před experimenty (načasování klíčení semen bylo stanoveno předem) byla semena zkušebních předmětů, pšenice, ovsa, ječmene, namočena na jeden den do vody. Potom byly rozloženy pinzetou s klíčkem nahoru (v jednom směru) do kyvety, na jejímž dně byla položena vrstva absorpční bavlny a nahoře dvě vrstvy filtračního papíru. Systém byl navlhčen vodovodní vodou na plnou vlhkost. K tomu byla voda vlita pod vatovou vlnu a po absorpci byl přebytek odstraněn. Kyveta byla pokryta fólií, její okraje byly ohnuty pod kyvetu. Klíčení bylo prováděno při teplotě +25 ° C - +26 ° C až do velikosti hlavní hmoty sazenic 10-15 mm a vzhledu kořenů, poté byly klíčky po celé délce rozděleny na zlomky.

Do šálků se umístí stejné množství promytého a kořeneného písku, do každého šálku se vysadí 10 identických sazenic testovacích rostlin. Písek je napájen shora shora stejným množstvím testovací vody z různých nádrží. Opakovatelnost je třikrát. Kontrola - zavlažování usazené a čištěné vody z vodovodu. Poté, co klíčky dosáhnou výšky 8-10 cm, jsou vykopány, usušeny filtračním papírem, rozděleny na části pomocí břitvy (stonek, kořeny), změřeny a zváženy. Data jsou zpracována statisticky, vyjádřena jako procento kontroly.

1. Způsob zavlažování sazenic zkušebních rostlin zkušební vodou

(Varianta 2).

Voda odebraná z různých zdrojů je koncentrována odpařením 10krát a uložena v lednici. Sklenice se naplní stejným množstvím promytého a kalcinovaného písku, na dno se vloží skleněná trubice, skrze kterou se provádí zavlažování, usazená vodovodní vodou. 18–20 kusů klíčících semen (řeřicha řeřicha, ředkvička) se vysévá do mělké hloubky. Po vylíčení klíčků a otevření kotyledonů se v šálcích ponechá 10 identických rostlin, zbytek se oškubá pinzetou. Zavlažování substrátu pro pěstování produkuje stejné množství vody trubicí pomocí nálevky vyrobené z fólie. Po 2-3 týdnech opatrně vylíhněte sazenice, promyjte, vysušte filtračním papírem, změřte a samostatně zvážte leteckou část a kořeny. Data jsou zpracována statisticky, vyjádřena jako procento kontroly.

1. Vývoj sazenic zkušebních rostlin při jejich zalévání zkušební vodou (jarní období).

Počet vzorků, místo odběru vzorků	Zkušební zařízení	Pozemní část,%
1. Řeka Podkumok
2. Novopyatigorskské jezero
4. Kontrola - voda z vodovodu

Toxický účinek vzorku se považuje za prokázaný, pokud experiment ukazuje toxický účinek inhibice růstu sazenic, zejména jejich kořenů, o 50% (Gruzdeva, 2002).

Z údajů v tabulce 1 je patrné, že pro růst a vývoj sazenic testovacích rostlin je nejvýhodnější vzorek č. 2 - Novopyatigorské jezero. Orlovka. Podle stupně růstu a vegetativní síly sazenic lze usoudit, že ve vzorku č. 1 (řeka Podkumok) je inhibice růstu sazenic kořenů inhibována o více než 50% ve srovnání s kontrolou, proto je toxicita vzorku č. 1 vysoká. Ve vzorku č. 3 (řeka Yutsa) je inhibice růstu jak v letecké části, tak v kořenech sazenic inhibována více než ve vzorku č. 1, proto je toxicita vzorku č. 3 velmi vysoká.

2.4. Vývoj sazenic zkušebních rostlin při jejich zalévání zkušební vodou

(podzimní období).

Počet vzorků, místo odběru vzorků	Zkušební zařízení	Pozemní část,%
1. Řeka Podkumok
2. Novopyatigorskské jezero
3. řeka Yutsa
4. Kontrola - voda z vodovodu

Z údajů uvedených v tabulce 2 je patrné, že v podzimním období je inhibice vývoje sazenic ve vzorku č. 3 - řeka Yutsa výraznější, inhibice růstu sazenic kořenů v tomto vzorku je více než 60% ve srovnání s kontrolou. U vzorků č. 1 - řeka Podkumok a č. 2 - Novopyatigorské jezero je také zaznamenán pokles vývoje vegetativních orgánů sazenic.

Při následném zpracování materiálů byly podle výsledků získaných v první výzkumné možnosti sestaveny diagramy biotestových testů.

Obr. 1 Poměr délky sazenic zkušebních rostlin při jejich zalévání zkušební vodou (jaro, podzim 2015)

Obr. 2 Poměr hmotnosti sazenic zkušebních rostlin při jejich zalévání zkušební vodou (jaro, podzim 2015)

Z výsledků získaných v možnosti 1 tedy můžeme usoudit:

toxicita přírodních vod na jaře je nejvyšší v řekách Podkumok a Yutsa;

ovesné sazenice jsou nejcitlivější na toxicitu pro vodu.

2.5. Vývoj sazenic testovacích rostlin (jaro).

Počet vzorků, místo odběru vzorků	Zkušební zařízení	Pozemní část,%
1. Řeka Podkumok	Řeřicha
2. Novopyatigorskské jezero	Řeřicha
3. řeka Yutsa	Řeřicha
4. Kontrola - voda z vodovodu	Řeřicha

Změnou nadzemní hmotnosti experimentálních vzorků ve srovnání s kontrolou lze posoudit toxicitu tohoto vzorku vody. Silná inhibice leteckých částí rostlin testovaných rostlin, více než 20% ve srovnání s kontrolou, ukazuje vysoký stupeň toxicity vzorku vody (Golubkina, 2008). Ve vzorku 3 - řeka Yutsa je pozorována vysoká toxicita. U sazenic je inhibice vývoje letecké části pozorována o 53-55% více než v kontrolním vzorku. Vzorky č. 1 - řeka Podkumok a č. 2 - Novopyatigorské jezero jsou také toxické, ale v menší míře.

2.6 Vývoj sazenic zkušebních rostlin (podzimní období).

Počet vzorků, místo odběru vzorků	Zkušební zařízení	Pozemní část,%
1. Řeka Podkumok	Řeřicha
2. Novopyatigorskské jezero	Řeřicha
3. řeka Yutsa	Řeřicha
4. Kontrola - voda z vodovodu	Řeřicha

Z údajů v tabulce 4 vyplývá, že nejtoxičtější vzorek číslo 3 - řeka Yutsa. Vzorek toxické vody č. 1 - řeka Podkumok. Test č. 2 - Novopyatigorské jezero má velmi nízkou toxicitu.

Podle výsledků získaných ve 2. výzkumné možnosti byly vytvořeny diagramy biotestových testů.

Obr. 3 Poměr délky sazenic testu (jaro, podzim 2015.)

Obr. 4 Poměr hmotnosti sazenic testované vody (jaro, podzim 2015)

Na základě výsledků studií můžeme konstatovat:

poměr délky a hmotnosti sazenic zkušebních rostlin závisí na toxicitě přírodních vod, čím více toxických látek ve vzorku vody, tím menší je délka a hmotnost sazenic zkušebních rostlin;

nejcitlivější na toxiny je potočnice.

toxicita přírodních vod je na jaře vyšší u vzorků vody odebraných z řek Podkumok a Yutsa;

méně toxický vzorek vody z jezera Novopyatigorsk.

Na základě studií byla zvládnuta metodika biologického testování toxicity přírodních vod, byla provedena analýza teoretických přístupů ke studiu tohoto tématu a následující závěry:

Zjistili jsme, že toxicita přírodních vod nádrží Pyatigorsk se sezónně mění: na jaře se toxicita na podzim více snižuje;

Bylo zjištěno, že vývoj a růst sazenic testovacích rostlin přímo závisí na stupni toxicity přírodních vod, rostliny s řeřichou a ovesem jsou na toxiny nejcitlivější;

Bylo zjištěno, že při zalévání sazenic test rostlin s testovanou vodou více brzdí vývoj kořenového systému;

Experimentálně bylo zjištěno, že vzorky vody z řek Yutsa a Podkumok se vyznačují nejvyšší toxicitou, zatímco voda z Novopyatigorského jezera je méně toxická.

Potvrzuje se tedy hypotéza o možnosti stanovení stupně znečištění přírodních vod pomocí biotestovacích metod. V této fázi práce, v důsledku experimentu, bez zvláštního nákladného vybavení, zařízení a činidel, byla stanovena úroveň znečištění vody v Pyatigorsku.

Naše práce může pokračovat v příštím školním roce. Chcete-li eliminovat chyby výsledku, můžete na základě laboratoře provést chemickou analýzu vody a znovu analyzovat situaci.

Tuto metodu analýzy přírodních vod lze doporučit amatérským zahrádkářům a všem obyvatelům našeho města, kteří se o tento problém zajímají.

Reference

Vishnyakova V.F. Ekologie území Stavropolu. - Stavropol, 2000.

Golubkina N.A. Laboratorní seminář o ekologii-M., 2008.

Grodzinsky A.M., Grodzinsky D.M. Rychlý odkaz na fyziologii rostlin. - Kyjev; Naukova Dumka, 1973.

Gruzdeva L.P. bioindikace kvality přírodních vod. // Biologie ve škole.2002, č. 6 10

Denisova S.I. Terénní praxe v ekologii. - Minsk, 1999.

Kulesh V.F., V.V. Mavrishchev Workshop o ekologii. Minsk, 2007.

Lysenko N.L. Bioindikace a biologické testování vodních ekosystémů .// Biologie ve škole.1996, č. 5, s. 12

Nikanorov A.M.,. Khoruzhaya T.A. Ekologie - M., Prior, 2001.

Ramad F. Základy aplikované ekologie. - L.: Gidrometeoizdat, 1981.

Trifonova T.A., Selivanova N.V., Mishchenko N.V. Aplikovaná ekologie. M., Akademický projekt., 2007.

Savelyeva V.V. Geografie území Stavropol. - Stavropol, 2003.

Stepanovskikh A.S. Ochrana životního prostředí - M .: UNITY-DANA, 2001.

Teoretická problematika biotestování. - Volgograd, 1983.

Fedorova A.I., Nikolskaya A.N. Workshop o ekologii a ochraně životního prostředí. - M., Vlados, 2001.

Filenko O.F. Metody biotestování kvality vodního prostředí. - M.: Moskevská státní univerzita, 1989

Yablokov A.V. Ekologie Ruska: stav perspektivy. 2005.

Dodatek 1

Tabulka 1

Hlavní vlastnosti metod hodnocení toxicity vody

	Chemické metody	Biologické metody
		Bioindikace	Biotest
Typ indikace	Indikace expozice	Indikace reakce	Indikace expozice
Předmět analýzy		Vodní společenství
Účel analýzy	Měření chemické koncentrace	Posouzení stavu přírodních společenství	Hodnocení integrální toxicity ve zkušebních organismech
Ukazatele toxicity	Překročení zavedených předpisů	Negativní změny komunity	Vývoj patologických změn (až do smrti) u testovaných organismů
Předpisy	Maximální přípustné koncentrace	Není nainstalován	Absence akutních a chronických toxických účinků
Metrologické charakteristiky	Přesnost, konvergence, reprodukovatelnost	Není nainstalován	Konvergence, reprodukovatelnost

Tabulka 2

Rozsah metod biologického testování toxicity ve vodním prostředí

Biotest Object		Účel biotestu	Testujte organismus
Chemikálie		Regulace rybolovu; kontrola toxicity v mezinárodním obchodu	Hydrobionty jsou zástupci hlavních trofických úrovní vodních ekosystémů. Standardní sada testovacích organismů
Výroba, zpracování a odpadní vody (bodové zdroje znečištění)		Hodnocení účinnosti čištění, identifikace nebezpečných složek, regulace vypouštění, environmentální certifikace podniků	Biotestové soupravy
Přírodní vody (ne bodové zdroje znečištění)		Ověření dodržování kvality vody se zavedenými předpisy. Posouzení toxikologického stavu vodních útvarů. Identifikace oblastí ekologické katastrofy a mimořádných událostí	Biotestové soupravy

Dodatek 2

Foto č. 1. Klíčky Řeřicha Foto č. 2. Řeřicha klíčky

(kontrola) (zkušenost)

Nyní se zaměřujeme na řešení problému výběru správného testovacího organismu. A zároveň uděláme představu celková toxicita vody v akváriu.

Ukázalo se, že obecnou toxicitu vody v akváriu můžete jednoduše zjistit pozorováním šneků.

Sama o sobě je to velmi jednoduchý a ne špatný nápad - vložit do testovaného vzorku nějaký organismus žijící ve vodě a zjistit, co se s ním stane. A pak se rozhodněte, zda je tato voda dobrá nebo špatná? Realizovat takový nápad znamená provést biotest. Zbývá pouze odpovědět na 2 otázky:
1. Jaký organismus ( bude se to nazývat testovací organismus) vybrat?

2. Co přesně by se s ním mělo stát, nebo na základě toho, jaké jevy lze posuzovattoxicita ?

Pokud vás však teoretické základy biotestování neobtěžují a chcete zjistit, jak lze pomocí šneků zjistit toxicitu vody, můžete část materiálu přeskočit níže a jít rovnou.

Který testovací orgán zvolit?

K dnešnímu dni byly některé navrženy. testovat organismy. (Testovací organismus je to nešťastné stvoření, jehož reakcí budeme posuzovat toxicitu vody). Byly vyvinuty přísné biotesty formálně přijaté Ministerstvem pro přírodní zdroje Ruské federace. Nejoblíbenějšími testovanými organismy byly dafnie a ciliates. Testy jsou založeny na kvantitativním posouzení jejich úmrtnosti. Podle počtu úmrtí je učiněn závěr o toxicitě. Zdá se, že to vše je pochopitelné, snadné a jednoduché, ale v praxi se ukázalo, že to není příliš poučné. Pokud experimentální zvířata uhynou, je zřejmé, že voda má toxický účinek, ale v jednom případě existuje rozdíl ve stupni toxicitynapříklad 40% dafnie zemřelo a dalších 60%? Zdá se, že tam, kde 60% je voda toxičtější, ale 40% je značná hodnota. Možná jen skupiny testovaných organismů nebyly příliš homogenní, pokud jde o odolnost jednotlivých jedinců vůči škodlivým vlivům, proto je rozdíl v procentech úmrtnosti a toxicita vzorků stejná?
Obecně se do popředí dostává otázka statistické spolehlivosti výsledků biotestování. Věřit či nevěřit výsledky biotestování do značné míry závisí na statistické správnosti experimentu. Ale nejen to. V neposlední řadě hodně záleží na výběru samotného testovacího organismu jako biologického druhu. Zde není možné brát v úvahu rysy jeho biologie a fyziologie. Vezměte stejnou dafnii znovu. Kde žije v přírodě? Upřímně řečeno, ne ve velmi čisté vodě. Chovatelé akvarijních ryb jdou chytit do jímek úpraven vody. Diskuse (a nejen jejich) nebudou v takové vodě žít a nebudeme pít takovou vodu - nebudou se jim líbit vůně a chuť. Žijí tam však dafnie a množí se rychle, stejně jako ciliaté. Je tedy možné na základě jejich reakcí posoudit toxicitu vody ve vztahu k nám (tj. Lidem) a akvarijním rybám? Pevně \u200b\u200bmám podezření, že je stále nemožné, bez ohledu na to, kolik autorů se pokouší dokázat opak. Nebudu se dále věnovat vědecké a vědecké džungli sporů týkajících se biotestování, ale budu popisovat testovací organismus, který použijeme v biotestu.
   Hodnotíme tedy toxicitu vody na základě jejího chování (zejména pomocíchování, ne smrtelností) hlemýžďová ampulka. O těchto šnecích si můžete přečíst sami. . Co dělá ampullarium nádherným? Ano, řada důležitých funkcí!

1. Amululie hlemýžďů jsou termofilní a mají vysokou úroveň metabolismu.

Při teplotě vody 25-30 ° C probíhají biochemické reakce v těle ampuláře pozoruhodně rychle. Hodně jedí, svinstvo a rostou energicky. A to znamená, že přítomnost toxických látek ve vodě rychle ovlivní metabolické procesy v jejich těle, což se projeví. Podstata působení toxických látek spočívá ve skutečnosti v tom, že narušují normální průběh biochemických reakcí. Toxické účinky lze rychle odhalit. Slovo „rychle“ znamená období od několika hodin do dvou dnů.

Foto 1. Zde jsou mladé šneky ampullarie. Jako testovací organismy jsou dobré díky intenzivnímu metabolismu. Fotografie tuto práci jasně demonstruje. Šipka ukazuje výstupy pláště, které sahají za okraje skořepiny. Možná zvětší kontaktní plochu pláště s vodou a usnadní dýchání kůže. Nebo možná nějak souvisí s rychlým růstem okraje skořápky. V každém případě, když jsou tyto výčnělky jasně viditelné u mladých hlemýžďů, jejich velikost se velmi rychle zvětší.

2. Vysoká citlivost a současně odolnost ampulky vůči toxickým účinkům.

Ampule mají pro testovaný organismus dvě důležité vlastnosti. Jsoucitlivý  na působení toxických látek (proč jsem vysvětlil výše uvedený bod), a zároveňodolný  (odolné) vůči nim (pouze soli mědi je zabíjejí již v nízkých koncentracích). Odolný - to znamená, že neumírají okamžitě. Mimochodem, proto jsou velmi dobřízahájit akvárium   jako „průkopnická zvířata“. S toxickým účinkem na tělo začnou jíst méně, lezou pomaleji, potřebují více nebo naopak méně kyslíku, zamknou se ve svém dřezu víkem a oplodí se před škodlivými účinky špinavé vody. To znamená, že chování otrávených šneků se liší od chování normálních. Šneci zahrnují všechny své ochranné mechanismy, které reagují na stresovou reakci na přítomnost toxické látky ve vodě a zůstávají naživu po dlouhou dobu, nebo se dokonce přizpůsobují stálé přítomnosti jedu ve vodě (viz takétoxicita ) To vše lze zaregistrovat a toxicitu lze posoudit na základě těchto behaviorálních reakcí. No a když se hlemýždi stanou úplně nemocnými (k tomu dochází, když 20 až 100krát nebo více překročí maximální přípustné koncentrace ve vodě) - zemřou. Poruchy chování ampulí tak mohou být detekovány i při velmi nízkých koncentracích toxických látek ve vodě (přibližně 0,01-0,1 maximální povolené koncentrace) a tyto hlemýždi umírají pouze při opakovaném předávkování. To znamená, že biotest s jejich použitím bude fungovat ve velmi širokém rozsahu toxicity. Důležitost této okolnosti lze vysvětlit následujícím příkladem. Hlavní nevýhodou testu dafnie je velmi úzký rozsah. Žijí bez znatelných odchylek od normy, dokonce i při významných koncentracích toxické látky (několik MPC, žeprvní článek o biotestu ), aniž by to odhalili, ale okamžitě umírají s dalším mírným zvýšením koncentrace.

3. Vysoká úroveň organizace ampule.

Ampule jsou poměrně složitě organizovaná stvoření (na rozdíl například od ciliatů). Mají téměř stejné anatomické a fyziologické systémy, jaké máte vy a já: nervový, motorický, trávicí, vylučovací, respirační, sexuální, humorální (systém hormonální regulace tělesných funkcí). Jejich tělo v reakci na různé škodlivé vnější vlivy reaguje s nespecifickou stresovou reakcí zahrnující všechny systémy. Na základě této reakce lze posoudit obecnou toxicitu vody, kterou lze určit nejen jednou toxickou látkou, ale celkovým účinkem mnoha znečišťujících látek přítomných ve vodě.

4. Chování ampuláru zahrnuje různé behaviorální reakce.

Jak jsem již napsal, chování ampulí je velmi rozmanité. To nám umožňuje posoudit toxicitu jejich prostředí odchylkou těchto behaviorálních reakcí od normy.

Video není viditelné, váš prohlížeč s největší pravděpodobností nepodporuje video HTML5

Ampularium má plíce i žábry. Ve vodě, jejíž oxidovatelnost je nízká, existuje velké množství kyslíku a hlemýždi dýchají hlavně pomocí žábru. Při větrání plic zřídka stoupá na povrch - ne více než jednou za 5-10 minut, nebo dokonce méně, při zachování vysoké motorické aktivity. Za dobrých podmínek jsou ampulária docela mobilní a mohou doslova „létat“ kolem akvária, zejména pokud mají hlad. Pokud měkkýš vstoupí do toxického prostředí, jeho tělo na to reaguje generalizovanou stresovou reakcí. V prvních hodinách prudce stoupá spotřeba kyslíku u šneků. Stále více začíná stoupat na povrch čerstvého vzduchu. Někdy intervaly mezi jednotlivými „ventilacemi“ plic začínají být jen několik desítek sekund. V některých případech měkkýš zůstává na povrchu umístěním sifonu ven. A motorická aktivita kochley se znatelně snižuje: plíží se méně a plíží se pomaleji než obvykle. Tyto příznaky jsou pozorovány například tehdy, když se povrchově aktivní látky (detergenty) dostanou do vody.
  Pro akvaristu není škodlivé pravidelně se podrobně dívat, jak jsou věci s jeho respirační a motorickou aktivitou? Pokud po výměně vody v akváriu náhle prudce vzrostla respirační aktivita, to je důvod, který má být vyplašen a změřte obsah ve voděamoniak a dusitan . Tyto látky mohou také způsobit zvýšenou respirační aktivitu. Nebo si možná vzpomínáte, že jste jeskyni omyli mýdlem a pak ji nepláchli silným proudem vody?
Se všemi pokračujícími toxickými účinky se metabolismus kochley začíná zpomalovat. Plazila se jen velmi málo nebo velmi pomalu, její tělo bylo téměř úplně vtaženo do dřezu a celé hodiny nevyvětrávala plíce - taková pozorování by měla akvaristovi vyvolat zvláštní poplach. V nejzávažnějších případech leží hlemýždi na dně nebo plavou na povrchu se zavřenou skořápkou. Pro lepší izolaci od toxických účinků vnějšího prostředí může hlemýžď \u200b\u200buvolnit velké množství hlenu, který izoluje mezeru mezi dřezem a víkem. Když škeble umře, víko se mírně otevře a tělo škeble vypadne. To je pro nezkušené akvaristy zavádějící. Myslí si, že šneci jsou naživu. Ve skutečnosti je šnek s pevně uzavřenou skořápkou ještě pravděpodobnější naživu než s mírně pootevřeným.

Pokud krmíte ryby plovoucím jídlem, pak hlemýždi, pokud se samozřejmě cítí dobře, mají tendenci se účastnit obecné hody. Sbírají plovoucí jídlo pomocí cest uvedených výše. Pokud se však amputace neustále vynoří na povrch a vytvářejí nálevky, i když tam nebylo žádné krmení, pak by to mělo být varováno. Zpravidla to znamená příliš vysoký obsah rozpuštěných organických látek ve vodě, které hlemýždi cítí čichem a chutí (odpovídající receptory jsou umístěny na knírcích a labiálních chapadlech). Vůně vůně jídel, jejichž polohu nelze lokalizovat (vůně je všude), ampullar správně věří, že jsou rozptýleny po hladině vody a plazí se, aby vytvořily nálevky, aby je mohly sbírat.
  Tato zvláštnost šnekového chování by měla být věnována pozornost při testování vody z letních chatek. Vysoký obsah organických látek v nich není neobvyklý. Jakmile jsou v této vodě, hlemýždi se shromažďují na povrchu a skládají nohy v nálevce. Je okamžitě zřejmé, že testovaná voda není příliš dobrá. V tomto akváriu, pomocí této behaviorální reakce, hlemýždi shromažďují bakteriální film a zvyšky krmiva z hladiny vody. To je velmi užitečná činnost. Ale zeptejte se sami sebe, proč se tento film tvrdohlavě objevuje? Možná jsi příliš mnohokrmit ryby nebo nedostatečnéprovzdušňovací filtrace?

Mluvil jsem o dvou behaviorálních reakcích ampulek, které nám umožňují vyvozovat některé závěry týkající se kvality vody. Nejedná se však o biologický test jako takový. Biotest je předem naplánovaná zkušenost dodaná v souladu s předpisy vyvinutými pro tuto metodu biotestování, která vám umožní získat statisticky spolehlivé výsledky. Tato metoda bude probrána v pokračování. Ale tyto behaviorální reakce jsem nezmínil marně. Z praktického hlediska jsou samy o sobě docela informativní. Kromě toho je hlemýždi často demonstrují a pro experimentátora je užitečné pochopit, co se děje během biotestu.
   A na konci tohoto materiálu, pojďme se zabývat dalším rysem amputace. Jak jsem řekl, mladí hlemýždi si velmi rychle staví skořápku. Tento proces je narušen silnými toxickými účinky vody. Podívejme se na fotografii na samém začátku článku. Skořápka tohoto chudého šneka je proříznuta hlubokou podélnou štěrbinou. To je velmi charakteristické porušení formace skořápky. Pokud vaše hlemýždi mají to samé, uvědomte si, že život ve vašem akváriu je velmi, velmi obtížný. Negativní vliv prostředí na organismus je takový, že již nemůže být kompenzován obrannými reakcemi těla a vede k morfologickým poruchám. Vzhledem k jeho vysokému odporu žije ampulárium, ale není to pro něj snadné. V akváriích, kde žijí hlemýždi s takovými skořápkami, je často pozorována „bezpříčinná“ smrt ryb. Navíc ryby často onemocní.

Pokud včas (pokud není podélná štěrbina příliš velká) ke zlepšení životních podmínek v akváriu: nepoužívejte léky obsahující měď a formalin z jakéhokoli důvodu nebo dokonce bez důvodu, častěji stanovujte biofiltraci a měňte vodu, pak ampule úspěšně obnoví celistvost skořápky. Jizva však zůstane navždy jako vzpomínka na jednou zažívané těžké časy.

Podrobnosti o konkrétní technice biotestu lze nalézt v článku. Domácí biotest, část II (biotest).

Vladimir Kovalev

Aktualizováno 11. dubna 2017